设计一种新型基于表位的四价亚单位疫苗对抗登革病毒：一种免疫信息学方法

《PLOS One》：Design of a novel epitope-based tetravalent subunit vaccine against dengue virus: An immunoinformatic approach

　　

登革热对全球造成深远影响，每年影响数百万人。其由伊蚊（Aedes）传播，给防治带来重大挑战，城市化和气候变化加剧了这一问题。尽管付出了努力，但迄今为止尚无完美的抗病毒治疗，凸显了疫苗的紧迫性。开发疫苗面临病毒四种独特血清型和复杂免疫反应等障碍。在这项研究中，研究人员采用免疫信息学方法设计了一种基于表位的四价亚单位疫苗，旨在对抗所有登革病毒（DENV）血清型。该研究考虑了表位预测和筛选、理化性质评估、分子对接、分子动力学（MD）模拟、免疫模拟和计算机克隆。疫苗构建体包含人β-防御素3佐剂（human β-defensin 3 adjuvant）和通过连接子连接的23个表位。值得注意的是，该疫苗的抗原性为0.9319，全球人口覆盖率为97.35%。与Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的分子对接显示出有希望的相互作用，最低能量分别为-1240.5 kJ/mol（76个成员）和-1393.3 kJ/mol（40个成员），表现出显著的静电、范德华（van der Waals）和其他相互作用。200纳秒的分子动力学（MD）模拟显示疫苗与受体稳定且灵活。溶剂可及性和回转半径也在合适范围内。三剂疫苗方案引发了强大而持久的多谱系免疫反应，其特征是稳定的B细胞和T细胞记忆、持续的监视以及高滴度抗体产生（IgM/IgG），以及促炎细胞因子谱（IFN-γ和IL-2）以有效清除抗原。这些发现表明，研究人员设计的疫苗优于迄今为止开发的任何其他登革疫苗。然而，由于这项研究是通过计算机方法（in silico）进行的，需要体外（in vitro）和体内（in vivo）验证以确认该疫苗作为临床试验的潜在候选者。

**研究背景与问题**
登革热（Dengue）由登革病毒（DENV，属于黄病毒科Flaviviridae）引起，通过伊蚊（Aedes aegypti）传播，全球约40亿人生活在风险区域，每年约4亿人感染，约10万人死亡。城市化、气候变化和国际旅行加剧了地理扩散。尽管世界卫生组织（WHO）推荐综合病媒管理，但至今尚无完全有效的抗病毒治疗或预防性疫苗。DENV存在四种血清型（DENV-1至-4），感染一种血清型后产生的抗体可能通过抗体依赖性增强（ADE）效应加重后续异型感染，因此疫苗需同时诱导针对所有四种血清型的平衡中和抗体和T细胞反应。目前已上市的两种疫苗（Dengvaxia?和Qdenga?）存在局限性：Dengvaxia?仅适用于9–16岁有既往感染史的人群，且可能增加初次感染者的重症风险；Qdenga?虽适用范围更广，但尚未获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。因此，急需开发一种能安全、广泛激活免疫系统且不依赖活病毒的新一代疫苗平台。
**研究目的与意义**
本研究旨在利用免疫信息学（Immunoinformatics）方法，设计一种基于表位（epitope）的四价亚单位疫苗，覆盖所有四种DENV血清型，并评估其抗原性、结构稳定性、受体结合能力及免疫应答潜力。该研究发表在《PLOS One》。
**主要关键技术方法**
研究人员从NCBI Genbank获取DENV-1至-4的全长多蛋白序列（NC_001477、NC_001474、NC_001475、NC_002640），作为样本来源。主要方法包括：通过ABCpred和IEDB工具预测B细胞和T细胞（MHC-I和MHC-II）表位，经VaxiJen和AllerTOP筛选抗原性和非过敏原性表位；利用Epitope Conservancy Analysis和Population Coverage工具评估表位保守性和人群覆盖；以人β-防御素3（hBD-3）为佐剂，用EAAAK、AAY、GPGPG、KK连接子组装表位构建疫苗；使用ExPASy ProtParam、SOLpro等评估理化性质和溶解度；通过PSIPRED预测二级结构，3Dpro和GalaxyRefine建模并优化三级结构，PROCHECK和ProSA验证；用ClusPro和HADDOCK进行分子对接（TLR2和TLR4），GROMACS进行200 ns分子动力学（MD）模拟；C-ImmSim进行免疫模拟；JCAT优化密码子并在pET-28a(+)载体中完成计算机克隆。
**研究结果**
- **病毒蛋白序列**：DENV-1至-4多蛋白长度分别为3392、3391、3390、3387个氨基酸，包含结构蛋白（C、prM、E）和非结构蛋白（NS1–NS5）。
- **B细胞表位预测与优先化**：基于ABCpred得分≥0.83、抗原性、非过敏原性及跨血清型保守性，最终选定5个B细胞表位（16个氨基酸长度），其中DENV-2仅1个，其余血清型各2个，部分表位共享。
- **T细胞表位预测与优先化**：从IEDB预测MHC-I（9-mer）和MHC-II（15-mer）表位，以IC50<100 nM、高抗原性、非过敏原性及跨血清型保守性优先，最终选定12个MHC-I和6个MHC-II表位。
- **疫苗构建体**：全长401个氨基酸，含人β-防御素3佐剂（EAAAK连接）、12个MHC-I表位（AAY连接）、6个MHC-II表位（GPGPG连接）、5个B细胞表位（KK连接），覆盖DENV-1（13个表位）、DENV-2（11个）、DENV-3（12个）、DENV-4（13个）。
- **理化性质与溶解度**：分子式C₁₉₅₀H₃₀₅₃N₅₂₅O₅₅₅S₁₇，分子量43.84 kDa，等电点pI=9.72，不稳定指数28.06（<40，稳定），亲水性（GRAVY=-0.444），溶解度评分（SOLpro 0.823、SoluProt 0.794、Protein-Sol 0.519）均支持可溶性。
- **抗原性、过敏原性与毒性**：VaxiJen抗原性0.9319（>0.4），ANTIGENpro验证0.813649；AllerTOP和AlgPred判定为非过敏原（AlgPred得分-0.6339）；T3DB数据库无匹配，提示无毒。
- **人群覆盖率**：全球97.35%，其中欧洲和北美最高（98.56%），东南亚91.53%，南美86.59%，平均HLA识别数3.53，PC90为1.74。
- **二硫键预测**：DIpro预测4对二硫键（Cys11–18、Cys33–40、Cys102–114、Cys270–357），有助于结构稳定。
- **二级结构**：PSIPRED预测15.71%为链（strand）、27.93%为螺旋（helix）、56.36%为无规卷曲（coil），置信度较高。
- **三级结构建模与优化**：GalaxyRefine优化后选取模型4，Ramachandran最适区93.1%，额外允许区6.3%，仅0.6%残基在不允许区（SER186和ARG191），GDT-HA=0.8953，RMSD=0.559，MolProbity=2.011，Z-score=-3.83。
- **分子对接**：与TLR2对接最低能量-1393.3 kJ/mol（40个成员），5个盐桥、19个非键接触、167个氢键；与TLR4对接最低能量-1240.5 kJ/mol（76个成员），9个盐桥、31个非键接触、297个氢键。HADDOCK分析显示疫苗–TLR4复合物HADDOCK得分-293.3，范德华能-106.2 kcal/mol，静电能-828.1 kcal/mol，BSA=3860.5 ?²；疫苗–TLR2复合物HADDOCK得分-208.3，范德华能-83.2 kcal/mol，静电能-477.6 kcal/mol，BSA=2754.0 ?²。
- **分子动力学模拟**：200 ns模拟显示疫苗–TLR2复合物平均RMSD=1.187 nm，RMSF=0.301 nm，Rg=3.99 nm，SASA=510.15 nm²；疫苗–TLR4复合物平均RMSD=1.913 nm，RMSF=0.640 nm，Rg=3.957 nm，SASA=501.11 nm²。两者均呈现稳定性和适当柔性。
- **免疫模拟**：三剂疫苗（间隔20天）诱导持久B细胞（>400/mm³）、T辅助细胞（~1400/mm³）、细胞毒性T细胞（~1100/mm³）记忆，高滴度IgM/IgG（>10,000 copies/mL），促炎细胞因子IFN-γ和IL-2升高，抗原快速清除，提示有效免疫应答。
- **计算机克隆**：密码子优化后CAI=1.0，GC含量53.78%，成功插入pET-28a(+)载体（NdeI/XbaI），最终质粒6480 bp。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该四价疫苗通过整合来自所有血清型结构和非结构蛋白的B细胞和T细胞表位，克服了既往疫苗血清型覆盖不全或抗原性不足的问题。人β-防御素3佐剂通过与TLR2/TLR4结合增强免疫原性。理化性质、溶解度、抗原性、非过敏原性及无毒特性支持其作为候选疫苗的可行性。分子对接和MD模拟显示疫苗与免疫受体稳定结合，免疫模拟预测了持久的多谱系免疫反应。计算机克隆验证了在大肠杆菌中高效表达的可能性。结论部分总结：本研究成功开发了一种针对所有DENV血清型的四价多表位亚单位疫苗，抗原性0.9319，全球人群覆盖率97.35%，理化性质优异，与TLR2/TLR4有良好相互作用，免疫模拟显示长期免疫应答，并在pET-28a(+)载体中成功克隆。但所有结果均基于计算机分析，需进一步体外和体内验证以确认其临床潜力。