《Brazilian Journal of Microbiology》：Evaluation of genomic characteristics of Escherichia coli associated with bovine mastitis and the potential utility of alternative antimicrobial methods
编辑推荐：
乳腺炎是一种影响乳牛的疾病，可由多重耐药的大肠杆菌引起，给农业部门造成损失。为了解决这一问题，研究具有抗菌活性的新物质至关重要。因此，本研究的目的是评估薄叶没药、尾果豆、剑麻提取物和高可溶性聚吡咯针对大肠杆菌分离株的疗效。研究使用了8个来自牛乳腺炎的大肠杆菌分
乳腺炎是一种影响乳牛的疾病，可由多重耐药的大肠杆菌引起，给农业部门造成损失。为了解决这一问题，研究具有抗菌活性的新物质至关重要。因此，本研究的目的是评估薄叶没药、尾果豆、剑麻提取物和高可溶性聚吡咯针对大肠杆菌分离株的疗效。研究使用了8个来自牛乳腺炎的大肠杆菌分离株和一株标准菌株。通过溴化乙啶挤出实验研究了外排泵（EP）的存在。测序在Illumina HiSeq 2500平台上使用2×150 bp文库进行，通过FastQC评估质量，并使用Unicycler完成组装。基因组注释以及耐药基因和毒力基因的鉴定分别使用PROKKA和PanViTa进行。通过Jspecies和来自NCBI的pyANI公共基因组实现了大肠杆菌的物种确认。最后，通过肉汤微量稀释法测定了抗菌活性。在针对分离株测试的天然产物中，只有尾果豆显示出抗菌活性，浓度为12,500 μg/mL，而Hs-PPy在250 μg/mL下显示出活性。分离株经测试对外排泵基因的存在呈阳性，但只有3个分离株在体外表达了该机制。天然产物对消除细菌无效。Hs-PPy是唯一对细菌表现出杀菌活性的化合物，证明其是杀菌作用的替代方案，即使在存在抑制其针对多种化合物作用的基因的情况下也是如此。
牛乳腺炎是以乳腺发炎为特征的常见疾病，导致牛奶质量下降、牲畜疼痛及乳品业重大经济损失。大肠杆菌作为革兰氏阴性机会性病原体，是临床与亚临床乳腺炎的主要诱因。由于多重耐药性（MDR）加剧及抗生素滥用，治疗面临严重危机。此外，细菌通过产生外排泵将药物排出细胞，进一步阻碍抗菌剂达到有效抑菌浓度，而传统植物药的效果往往受限。在此背景下，研究人员旨在评估三种植物提取物及高可溶性聚吡咯对携带耐药及毒力基因的乳腺炎大肠杆菌分离株的治疗潜力。该研究指出，尽管受试分离株未完全达到多重耐药标准，但其携带的耐药与毒力基因使其可能成为细菌间基因水平转移的潜在储库。最终结论表明，Hs-PPy具有卓越的抗菌活性，即使面对外排泵等抑制机制仍能发挥杀菌作用，且不影响乳品安全，是控制牛乳腺炎大肠杆菌的有效替代抗菌方法。该研究成果已发表在《Brazilian Journal of Microbiology》。
研究主要采用以下关键技术方法：样本队列来源于2020年2月至6月间采自巴西巴拉那联邦大学实验农场的牛乳样本，分离出8株大肠杆菌。利用溴化乙啶挤出实验进行外排泵表型检测；在Illumina HiSeq 2500平台进行测序，使用FastQC控制质量，Unicycler进行基因组组装；通过PROKKA与PanViTa进行功能注释及耐药和毒力基因鉴定；利用Jspecies和pyANI分析进行物种分类确认；采用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。
研究结果如下：
抗菌药物敏感性测试：分离株对多数测试抗生素表现出敏感性。无分离株被归类为多重耐药菌，多重抗生素耐药指数（MAR）介于0至0.25之间，但对头孢氨苄的耐药率最高。
外排泵的表型检测：通过溴化乙啶观察发现，33、44和58号分离株具有外排泵活性，可泵出荧光化合物，而其余分离株及标准株则无此表型特征。
基因组组装：组装后的基因组表现出高质量和一致性，最大污染水平仅为0.1%。
分类学：利用JSpecies进行的物种水平分类确认所有分离株均为大肠杆菌，Z值大于99.9%。平均核苷酸同源性（ANI）分析显示所有结果均超过95%的物种鉴定阈值。
耐药基因与毒力基因组：分析鉴定出多个外排泵相关基因，包括主要促进子超家族（MFS）成员、耐药结节分化（RND）家族的AcrAB-TolC系统及小多重耐药（SMR）家族等。同时发现了与细菌黏附和运动相关的毒力基因，如fim基因家族和鞭毛合成相关基因。
肉汤微量稀释法抗菌活性：薄叶没药提取物未表现出抗菌活性；剑麻提取物仅在最高测试浓度下对标准株有微弱作用；尾果豆提取物对分离株的MIC和MBC均为12,500 μg/mL；而Hs-PPy表现出最优抗菌活性，对所有分离株及标准株的MIC和MBC均仅为250 μg/mL，且统计学差异显著。
研究讨论部分总结称，多数分离株对常用抗菌药敏感，但由于携带如AcrAB-TolC和KpnEF等广谱外排泵系统及大量毒力基因，其在宿主中的持续定植能力及潜在的基因水平转移风险令人担忧。植物提取物因革兰氏阴性菌的结构复杂性而效果有限，而Hs-PPy展现出显著的杀菌优势。研究结论指出，虽然C. leptophloeos提取物缺乏抗菌活性，但Hs-PPy的抗菌活性显著优于A. cearensis和A. sisalana提取物。即使大肠杆菌分离株携带阻碍化合物作用的外排泵、毒力及耐药基因，Hs-PPy仍能有效杀灭细菌，证明其是控制该类耐药大肠杆菌及治疗牛乳腺炎极具潜力的替代方案。
