《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Integrated meta-analysis of human astrocytes transcriptomes reveals a candidate recurrent inflammatory signature in response to inflammatory and immune stimuli
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星形胶质细胞是中枢神经系统中介导炎症和免疫应答的关键调节因子，尤其是在病理条件下。研究人员对NCBI GEO和ENA数据库进行了系统性检索，以识别受刺激星形胶质细胞的转录组学研究。本项Meta分析整合了11个RNA-Seq数据集，共包含153个样本（91个受刺
星形胶质细胞是中枢神经系统中介导炎症和免疫应答的关键调节因子，尤其是在病理条件下。研究人员对NCBI GEO和ENA数据库进行了系统性检索，以识别受刺激星形胶质细胞的转录组学研究。本项Meta分析整合了11个RNA-Seq数据集，共包含153个样本（91个受刺激样本和62个对照样本），这些样本暴露于促炎刺激物下，如细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）、棕榈酸以及SARS-CoV-2和伯氏疏螺旋体等病原体。通过稳健秩聚合（RRA），研究人员识别出130个差异表达基因，其中包括125个上调基因和5个下调基因。功能富集分析显示，这些DEGs主要参与免疫和炎症通路，如细胞因子信号传导、干扰素应答和核因子κB（NF-κB）激活。网络分析揭示了五个核心节点：CXCL10、DDX58、IFIH1、IL-1β和TLR3，凸显了它们在星形胶质细胞炎症信号传导中的重要性。这些发现强调了星形胶质细胞作为免疫活性细胞的能力，它们通过NOD样受体和NF-κB通路等机制协调炎症应答。尽管NF-κB的慢性激活与炎症相关，但该通路在突触可塑性中也扮演重要角色。此外，在不同的炎症刺激下，DDX58和IFIH1的持续上调表明星形胶质细胞会向一种共同的“反应性”状态转变，这可能导致慢性神经炎症。本研究确定了一个候选基因特征，并强调了星形胶质细胞在炎症过程中的双重保护和病理作用。
引言
星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）发挥正常功能所必需的胶质细胞，在维持大脑稳态方面具有多种功能，包括调节血流、为神经元提供代谢和抗氧化支持、分泌促炎和抗炎分子、调节离子和神经递质平衡以及控制免疫细胞激活。此外，作为免疫活性细胞，星形胶质细胞可通过发生“反应性转化”来表达损伤相关分子模式和病原体相关分子模式受体。反应性星形胶质细胞增生是一个防御过程，在此过程中星形胶质细胞发生一系列变化以最小化并修复损伤。然而，当神经保护和神经毒性作用之间发生失衡时，这种反应性也可能产生有害影响。神经炎症反应主要是由多种介质驱动的，由于星形胶质细胞在解剖位置、功能可塑性以及放大炎症信号方面的优势，使其成为神经免疫环境的核心调节者。由于神经炎症与严重的病理状况相关，研究星形胶质细胞对各种刺激反应的反应性和潜在分子机制至关重要。当前的国际共识指南强调，A1/A2的二元命名法过于简化了反应性的多维本质。尽管存在大量特定刺激的转录组数据，但人类星形胶质细胞反应性的跨刺激“核心”特征仍然难以捉摸。本项Meta分析旨在揭示一种候选的反复出现的炎症基因特征。
方法学
研究策略和纳入排除标准：研究选择过程根据PRISMA 2020指南进行。系统性搜索在多个数据库以及基因表达综合和欧洲核苷酸档案库中进行。研究需满足以下纳入标准：原代文章发表于2017年至2023年间；具有配对样本的实验设计；模型为人类星形胶质细胞；使用促进炎症过程的分子或制剂进行刺激；通过RNA-seq进行转录组分析；以及原始RNA-seq数据可用。排除了非配对样本、肿瘤组织模型、神经退行性疾病患者样本以及在刺激前进行过基因操作的研究等。筛选过程由独立审查人员进行。
RNA-seq数据提取和预处理：下载选定研究的原始测序读长文件，并在Galaxy平台上进行生物信息学分析。使用FASTQC工具进行初始质量分析，通过Trimmomatic过滤衔接子，使用SortMeRNA工具去除核糖体RNA。利用STAR工具将非核糖体RNA与参考基因组比对，使用HTSeq-count进行基因水平定量。通过Limma-Voom包进行差异表达分析，并采用TMM标准化方法进行校正。采用Benjamini–Hochberg方法计算调整后的p值。
稳健秩聚合：根据logFC值对基因进行排序，并使用RobustRankAggreg包进行聚合。调整后p值小于0.05且|log2FC|大于1的基因被认为在RRA分析中是显著的DEGs。
功能富集和通路分析：使用gProfiler工具进行基因本体和通路富集分析，包括GO生物学过程、Reactome和KEGG通路。使用g:SCS多重检验校正方法评估统计学显著性。此外，利用REVIGO工具去除冗余的GO术语。
蛋白质-蛋白质相互作用网络：通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络以优先排序高度连接的基因。使用Cytoscape软件进行可视化，计算包括度、中介中心性等在内的关键中心性指标。利用MCODE插件识别网络内的功能模块。
结果
共选择了11个RNA-Seq数据集进行分析，总计153个样本，包括91个受刺激样本和62个对照样本。使用的刺激物包含促炎分子以及病毒和细菌等病原体。星形胶质细胞来源多样，包括诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞以及原代和胎儿星形胶质细胞。
读长处理和比对：生物信息学分析表明，经过质控和过滤，平均91%的读长保留下来，平均只有1.87%的读长为核糖体污染。比对结果显示，平均83.68%的读长唯一比对到参考基因组，总计93.6%的读长比对成功，证明了数据的高质量。
稳健秩聚合分析：从RRA分析中共识别出130个DEGs，其中125个上调，5个下调。上调的前几个显著基因包括SOD2、CXCL8、VCAM1等，下调的基因为IL17D、GDF10等。通过分层热图展示了这些基因的表达模式。
功能富集和通路分析：5个下调基因在炎症相关的生物学通路中没有显示出显著的聚类。相反，125个上调基因的功能富集分析揭示了免疫相关通路的显著激活，例如“免疫系统中的细胞因子信号传导”和“干扰素α/β信号传导”等。此外，还发现了与病毒感染相关的通路以及其他相关通路，如白细胞介素信号传导、TNF、NF-κB和趋化因子受体相互作用。通过REVIGO分析将功能列表浓缩为26个关键生物学过程，并识别出两个主要聚类：免疫应答和炎症应答。该过程将初始基因集缩减为33个用于构建PPI网络的基因。
蛋白质-蛋白质相互作用网络：基于与免疫应答和炎症相关的33个节点构建了PPI网络。通过多参数拓扑过滤识别关键节点，确定了五个主要节点：CXCL10、DDX58、IFIH1、IL-1β和TLR3，它们表现出最高的连接性和中心性。此外，MCODE聚类分析识别出三个连接模块。模块1主要与抗病毒天然免疫应答的激活相关，模块2涉及通过MHC I类的抗原处理和呈递，模块3集中于细胞因子信号传导和NF-κB通路的激活。
讨论
星形胶质细胞在维持生理稳态和对损伤或感染作出反应中发挥着关键作用。通过采用稳健秩聚合，本Meta分析在高度异质的数据集中识别出一个由130个基因组成的候选反复免疫和炎症特征。这些基因中很大一部分与免疫应答相关。KEGG和REACTOME通路富集分析揭示了关键炎症通路的富集，包括TNF、NF-κB和NOD样受体信号传导。研究表明，转录组数据得出的通路富集分析反映了基因表达的协调变化。
NF-κB通路在免疫应答、细胞增殖和凋亡中起关键作用。在星形胶质细胞中，NF-κB在突触谷氨酸清除、代谢调节和结构可塑性中发挥重要作用。然而，在病理条件下，慢性NF-κB信号传导与下游靶基因的转录相关，促进促炎因子的表达和释放，从而可能导致不良的神经系统后果。此外，NF-κB不仅作为转录因子，还作为关键的信号转导介质，将胞外炎症信号与下游基因表达程序联系起来。
基于PPI网络分析的前五个核心节点表现出高度连接性。本研究的一个显著发现是细胞质传感器DDX58（RIG-I）和IFIH1（MDA5）在多种非病毒炎症环境中的一致上调，这表明星形胶质细胞可能采取一种抗病毒模拟的表型状态，参与“无菌”炎症反应。从机制上讲，这种状态可能是通过应激下内源性逆转录元件或线粒体DNA/RNA释放的感应来协调的。两者均为RIG-I样受体家族成员，在介导I型干扰素转录诱导中发挥关键作用。
此外，DDX58和IFIH1参与了典型的PRR信号通路，该通路通过激活Toll样受体通路相互作用。TLR3是由人类星形胶质细胞表达的受体，被激活后会启动导致IFN-β产生以及MAP激酶和NF-κB激活的信号级联反应，促进炎症相关通路。TLR3在星形胶质细胞中的激活会导致延长性炎症，引起多种编码细胞因子、趋化因子等基因的上调。
CXCL10被识别为具有高连接性的核心节点。研究表明它可作为星形胶质细胞驱动的神经炎症反应中Th1和NK细胞募集的主要守门人。CXCL10的分泌已被证明在多发性硬化症等条件下介导T细胞向大脑的募集，也可能破坏血脑屏障完整性，从而促进外周免疫细胞的积累和免疫反应的扩大。
IL-1β被认为是主要促炎细胞因子之一，在免疫和中枢神经系统中均发挥关键作用。在生理条件下，尤其是衰老过程中，星形胶质细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平的升高可能促进神经退行性疾病的发展。本分析中确定的基因和通路为在病理条件下关于星形胶质细胞相关炎症程序的假设生成提供了基础。
本研究强调了星形胶质细胞在响应炎症刺激时作为免疫活性介质的核心作用。TNF、NF-κB和NOD样受体等通路中基因的差异表达可能反映了天然免疫系统的激活。在解读这些结果时需考虑几项局限性，例如星形胶质细胞来源和发育成熟度的差异可能影响观察到的转录模式，以及同一数据集内多重治疗对照对比的存在可能引入偏倚。所报告的候选炎症特征应在分析的数据集背景下进行解释，且基于网络连接性识别的候选核心节点并不应被直接解释为星形胶质细胞炎症反应的驱动因素。
