微流控解离脾脏以回收免疫细胞用于生物技术和单细胞分析

《Frontiers in Immunology》：Microfluidic dissociation of spleen to recover immune cells for biotechnology and single cell analysis

　　

引言：脾细胞（splenocytes）对于医学和生物技术中的多种应用至关重要，但分离方法常常受限于低产量、低活力、对某些细胞亚型的偏向性以及表面标志物表达的降解。在此，研究人员采用微流控装置（microfluidic device），通过非酶解、酶解和联合方法解离脾脏组织并分离单个脾细胞。方法：研究人员将脾脏样本切碎并在芯片上使用无酶缓冲液进行消化，以评估主要非贴壁CD45⁺白细胞群（CD45⁺ leukocyte populations）的短期释放。随后，研究人员通过比较非酶解和酶解方案随时间的变化，评估了树突状细胞（dendritic cells）和巨噬细胞（macrophages）的分离。使用一种联合方案，即先进行缓冲液冲洗，再进行胶原酶（collagenase）消化，以平衡酶暴露并最大化回收率。结果：与传统滤网研磨和胶原酶消化对照相比，微流控消化在CD45⁺白细胞群中的非贴壁脾细胞（B细胞（B cells）和T细胞（T cells）亚群）和贴壁脾细胞（树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞（neutrophils））中获得了更高的细胞回收率和活力。研究人员对B细胞进行了功能验证，使用最终方案分离并培养六天，结果显示其增殖、活力和抗体产生水平与对照组相当。讨论：未来研究将使用功能测定和医学及生物技术中的下游应用评估其他脾细胞亚群。

脾脏作为免疫系统的关键器官，包含红髓和白髓两大结构，分别容纳巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞等免疫细胞亚群。脾细胞在生物技术中具有重要应用，包括单克隆抗体生产、细胞毒性实验、疫苗测试和过继细胞转移，同时单细胞RNA测序等分析技术对脾脏免疫异质性的研究需求日益增长。然而，传统脾脏解离方法（如滤网研磨、载玻片剪切或胶原酶消化）存在产量低、活力差、偏向特定细胞亚型、表面标志物降解等问题，且手动操作可能影响操作间重复性，尤其对于单细胞分析，解离过程可能引入基因表达变化或细胞碎片残留，导致结果偏差。为此，研究人员采用微流控装置解离小鼠脾脏，旨在通过非酶解、酶解和联合方案，以更高效、高活力的方式回收免疫细胞，支持生物技术应用和单细胞分析。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

研究人员使用微流控消化装置，该装置由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层经激光加工制成，内含15 μm和50 μm孔径的尼龙膜，通过蠕动泵循环缓冲液或胶原酶I进行解离。实验采用间隔操作模式，在指定时间收集细胞悬液并更换新鲜缓冲液或酶液。样本来源为6-9月龄小鼠的脾脏，雌雄均有，但不作为生物学变量控制。与传统滤网研磨（100 μm孔径）和管式胶原酶消化（60分钟，37°C）方法对比，通过流式细胞术分析细胞回收率和活力，并进一步对B细胞进行功能验证（培养6天，检测增殖、活力和IgG分泌）。

**Characterizing non-enzymatic dissociation**
在非酶解条件下，研究人员以10或20 mL/min流速通过微流控装置处理脾脏组织，间隔时间为0.25、1和3分钟，并与滤网研磨对照比较。流式细胞术分析显示，20 mL/min流速下，仅15秒即回收超过60,000个白细胞（CD45⁺）每毫克组织，是滤网对照的2倍；3分钟后总回收超过140,000个白细胞每毫克，为对照的4倍以上。所有微流控条件下的白细胞活力均约90%，显著高于对照的80%。结果表明，微流控装置在非酶解条件下可快速、高效地释放白细胞，且活力更高。

**Characterizing enzymatic dissociation**
研究人员将胶原酶I循环液与微流控装置结合，间隔时间设为5、15和60分钟，并与管式胶原酶消化对照及微流控缓冲液条件比较。流式细胞术扩展至树突状细胞（CD11c^hi MHC class II⁺）和巨噬细胞（F4/80^hi）。结果显示，微流控酶解条件下总白细胞回收超过650,000个每毫克，为对照的4倍以上；树突状细胞回收约16,000个每毫克，为对照的5倍以上；巨噬细胞回收约45,000个每毫克，为对照的3倍以上。所有细胞类型在微流控条件下活力均>90%，高于对照的85%。此外，5分钟间隔的树突状细胞活力最高（约95%），随处理时间延长略有下降。

**Combined dissociation protocol**
研究人员开发了联合方案：先以缓冲液循环2分钟释放非贴壁或弱贴壁细胞，随后切换至胶原酶I继续消化（5、15、60分钟）。与滤网研磨和管式酶解对照比较，流式细胞术分析显示，微流控联合方案总白细胞回收约460,000个每毫克，为酶解对照的2倍以上、滤网对照的2.5倍以上；树突状细胞回收约13,000个每毫克，为酶解对照的2倍以上、滤网对照的4.5倍以上；巨噬细胞回收约30,000个每毫克，为滤网对照的2倍，但未达显著差异。进一步使用第二套流式细胞术面板（包括B细胞（CD19⁺）、中性粒细胞（CD11b⁺ Ly6G⁺）、细胞毒性T细胞（CD3⁺ CD8a⁺）和其他T细胞（CD3⁺ CD8a^-））分析，结果显示微流控联合方案中B细胞回收约310,000个每毫克，为酶解和滤网对照的3.4倍以上；中性粒细胞回收约4,000个每毫克，为滤网对照的4.4倍；细胞毒性T细胞回收约64,000个每毫克，为酶解对照的5倍；其他T细胞回收约110,000个每毫克，为酶解和滤网对照的3-4.8倍。所有细胞亚型在微流控条件下活力均>90%，而对照多低于80%或90%。此外，细胞亚群百分比随处理时间变化，如树突状细胞和巨噬细胞在后期时间点富集，而B细胞和T细胞在早期时间点富集，表明处理时间可粗筛细胞亚群。

**Evaluation of B cell function**
研究人员使用最终联合方案从微流控装置收集B细胞，经荧光激活细胞分选（FACS）分离后培养6天，与滤网和酶解对照比较。培养第3天，微流控组细胞计数高于对照（但无统计学差异）；第6天，各组细胞计数相当，但均显著高于酶解对照第3天计数。活力方面，第3天各组均约90%，第6天降至约80%。IgG分泌水平通过ELISA检测，第6天所有条件均较第3天显著增加12倍以上，且各组间无显著差异。结果表明，微流控装置分离的B细胞在增殖、活力和抗体产生方面与对照相当，同时产量更高。

讨论部分指出，微流控装置通过结合流体剪切力和酶消化，在非酶解条件下即可快速释放白细胞，酶解条件下大幅提高贴壁细胞产量，联合方案进一步优化回收。活力方面，微流控条件始终优于传统方法，可能因减少机械损伤和酶暴露时间。本研究功能验证限于B细胞，未来需扩展至T细胞、树突状细胞和巨噬细胞。此外，将探索更高流速、更多酶类型（如胶原酶D、Liberase）以及更多间隔，以优化回收。研究还将通过单细胞RNA测序检测更多细胞亚型（如自然杀伤细胞），并整合临床相关功能测定（如细胞因子多重分析和T细胞启动实验），以推动治疗应用。结论部分翻译如下：在本工作中，研究人员已证明，使用微流控消化装置解离小鼠脾脏，能够比传统方法更有效地分离主要细胞亚型。研究人员展示了在酶解、非酶解甚至联合操作模式下，更高流速和间隔操作增强了白细胞回收，而未对活力产生不利影响。在可保留细胞表面标志物的非酶解条件下，装置的白细胞（CD45⁺）产量达到或超过常用的滤网对照方法。在酶解条件下，装置操作显著增加了白细胞和贴壁细胞产量。使用联合方案（先进行非酶解缓冲液冲洗，再进行胶原酶消化），装置处理在树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞和T细胞亚群中均获得了比对照更高的产量和活力。本研究的功能验证限于B细胞，其在培养中表现出与对照相当的增殖、活力和抗体产生水平。未来工作将扩展至其他关键细胞群，并提高装置通量，同时探索更多下游应用，包括单细胞RNA测序和高参数免疫表型分析。