一个果蝇teissieri I因子反转录转座子的ORF1p在果蝇melanogaster雌性种系中表现出RNA结合顺式偏好

《Genome》：A Drosophila teissieri I-element retrotransposon’s ORF1p shows RNA binding cis-preference in the D. melanogaster female germline

　　

来自黑腹果蝇的可转座I因子编码一种RNA结合蛋白ORF1p，该蛋白是其反转录转座所必需的。ORF1p在体外非特异性结合单链DNA和RNA。如果这种非特异性RNA结合发生在种系中，那么研究人员假设它在产生除I因子之外的其他基因的可遗传反转录拷贝中发挥作用。本研究旨在通过研究雌性种系中ORF1p RNA结合的特异性来检验该假设。为此，研究人员克隆了一个来自D. teissieri的I因子。研究人员首先测试了该因子转基因的D. melanogaster品系中其RNA和蛋白质表达以及转座情况，并证明其具有与之前分离的D. teissieri和D. melanogaster I因子相似的性质。然后，研究人员使用表位标记的HAORF1p进行RNA免疫沉淀（RIP）从卵巢提取物中富集RNA，随后进行高通量测序（RIP-seq），发现HAORF1p以高特异性结合顺式RNA。因此，除非I因子ORF1p罕见或低亲和力结合宿主细胞RNA，否则它似乎不在雌性种系中通过反式结合宿主细胞RNA来产生反转录拷贝中发挥作用。

论文解读文章

**研究背景、存在问题及研究目的**

反转录转座子是一类通过RNA中间体进行复制并插入基因组的转座元件。其中，非长末端重复（non-long-terminal repeat, non-LTR）反转录转座子（如果蝇中的I因子和人类中的LINE-1）通常编码两种蛋白：ORF1p和ORF2p。ORF1p具有RNA结合和分子伴侣功能，而ORF2p负责靶标引物反转录（target-primed reverse transcription, TPRT）。除了自我复制外，这些反转录转座子还可能通过反式作用（in trans）结合其他细胞RNA，将其反转录并插入基因组，从而产生可遗传的基因反转录拷贝（retrocopies）。已有研究表明，人类L1 ORF1p在细胞系中能结合多种RNA，包括其自身RNA和宿主细胞RNA，且这些结合的RNA常与加工假基因相关。然而，在果蝇中，I因子ORF1p在体外显示非特异性结合单链DNA和RNA，但其在体内（尤其是种系中）的结合特异性尚不清楚。如果I因子ORF1p在雌性种系中也能非特异性结合其他RNA，则可能参与宿主基因反转录拷贝的产生。因此，本研究旨在通过转基因系统，利用D. teissieri I因子在D. melanogaster中表达，并利用序列差异区分顺式与反式结合，从而检验ORF1p RNA结合的特异性及其在反转录拷贝产生中的作用。该论文发表在《Genome》上。

**主要技术方法**

研究人员首先克隆了野生型D. teissieri的完整I因子序列，并构建了三种转基因构建体：完整I因子（Dt-I）、HA标签标记的完整I因子（Dt-I-HAORF1）以及仅表达HAORF1p的构建体（HAORF1），均通过P-元件介导转化至D. melanogaster的w-K品系（反应性品系）。通过PCR筛选检测转座事件，并利用Splinkerette PCR验证新插入位点。使用qRT-PCR检测I因子RNA表达及亲本效应。通过免疫荧光染色观察HAORF1p在卵子发生过程中的定位。核心方法为RNA免疫沉淀（RIP）结合高通量测序（RIP-seq）：从雌性卵巢提取物中，用抗HA抗体免疫沉淀HAORF1p结合的RNA，随后进行链特异性RNA-seq文库构建和测序。计算分析使用STAR比对、PEAKachu鉴定富集峰。此外，用qPCR验证部分峰的富集倍数。

**研究结果**

1. **Background and rationale for using an I-element from D. teissieri to study ORF1p in D. melanogaster**
研究人员利用D. teissieri I因子与D. melanogaster I因子的序列差异，能够在转基因背景下区分顺式与反式结合。在反应性品系（w-K）或aubergine（aub）突变体（piRNA通路缺陷）中，I因子表达和转座不受抑制，适合研究。

2. **Our Drosophila teissieri I-element sequence is highly similar to previously isolated I-elements**
新克隆的D. teissieri I因子序列（GenBank PP116460）与先前报道的活性D. teissieri I因子和D. melanogaster I因子具有高度核苷酸和氨基酸序列相似性，ORF1p中的三个锌指样CCHC基序（Zn knuckles）保守，表明其功能完整。

3. **Design of three D. teissieri I-element transgenes**
构建了三种转基因：Dt-I（完整I因子）、Dt-I-HAORF1（HA标签插入ORF1第二个密码子后）和HAORF1（仅ORF1加HA标签）。所有转基因均受UASp启动子控制，可由nanosGAL4驱动在雌性种系中表达。

4. **Drosophila teissieri I-element can transpose in transgenic D. melanogaster**
通过PCR筛选，从Dt-I(3-2)品系的白眼雄性后代中检测到一个转座事件。Splinkerette PCR验证显示该插入为全长I因子，带有14 bp靶位点重复（target site duplication, TSD），侧翼为roo转座元件序列，无转基因载体序列，证明其自主转座能力。

5. **Drosophila teissieri full I-element transcripts are expressed autonomously and are weakly sensitive to parental effects in a w-K genetic background**
qRT-PCR显示，在w-K背景中，Dt-I-HAORF1(10-1)和Dt-I(3-2)均能自主表达，且亲本效应微弱。当与nanosGAL4品系杂交时，若母本为nanosGAL4（诱导品系），则F1雌性中I因子表达显著降低，符合piRNA介导的沉默效应。

6. **HAORF1p localizes to the oocyte, consistent with previous studies**
免疫荧光染色显示，在完整I因子转基因背景下，HAORF1p从早期卵室开始表达，分布于滋养细胞和卵母细胞，并在卵母细胞后极富集，10期左右转向前部。在nanosGAL4驱动下，表达更强，定位模式相似。单独HAORF1转基因（无ORF2）在nanosGAL4驱动下，HAORF1p也积累于卵母细胞，但缺乏后期前部定位，符合“Loc-”表型，表明ORF2序列对前部定位至关重要。

7. **RNA immunoprecipitation of HAORF1p shows highly specific binding to its transcript**
通过RIP-seq实验（实验1：aub^?; HAORF1(119A)/nanosGAL4；实验2：Dt-I-HAORF1(10-1)/nanosGAL4），比较抗HA抗体IP与对照IgG IP的RNA富集峰。结果显示，在两种遗传背景下，显著富集的转录本极少，且主要重叠于D. teissieri I因子转基因转录本自身。具体而言，HAORF1转基因的富集峰位于ORF1起始500 nt区域；Dt-I-HAORF1转基因的富集峰包括I因子5′UTR和ORF1起始区，以及ORF2中的两个峰（位于Loc序列两侧）。此外，polyA结合蛋白基因（pAbp）的RB转录本3′UTR在两个实验中均有富集，而Calmodulin（Cam）和Gp150仅在实验1中富集。qPCR验证了Dt-I-HAORF1峰2和峰4以及pAbp峰的富集趋势。这些结果表明，I因子ORF1p在雌性种系中几乎完全结合自身RNA，表现出高度顺式偏好，而反式结合其他RNA的事件极为罕见或亲和力极低。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究开发的基于D. teissieri I因子的转基因系统为研究ORF1p RNA结合提供了有效工具。多项证据表明该I因子具有自主活性：序列高度保守、检测到具备典型特征的转座事件、转基因表达且HA标签不影响功能。与之前研究一致，单拷贝D. teissieri I因子在反应性品系中不能诱导品系转换，仅产生微弱亲本效应。HAORF1p的定位模式与已知I因子ORF1p一致，且ORF2的Loc序列对前部定位必要。RIP-seq结果明确显示ORF1p优先结合自身RNA，反式结合极少，这与人类L1 ORF1p在细胞系中可结合多种RNA的发现不同。pAbp转录本的富集可能与其在果蝇群体中存在的多态性反转录拷贝有关，但机制不明确。研究结论：I因子ORF1p在雌性种系中的RNA结合具有强烈顺式偏好，不支持其通过反式结合宿主RNA参与反转录拷贝产生的假设；除非这种结合极为罕见或低亲和力。未来的研究可使用纯化的成熟卵母细胞而非整个卵巢，以更精确地分析转座发生时的结合特异性。