日本养殖鱼类存档分离株中Lactococcus petauri的回顾性鉴定：致病性与分子流行病学

《Journal of Fish Diseases》：Retrospective Identification of Lactococcus petauri Among Archived Isolates From Farmed Fish in Japan: Pathogenicity and Molecular Epidemiology

　　

乳球菌病（Lactococcosis）由Lactococcus garvieae、L. formosensis和L. petauri引起，是全球养殖鱼类的一种重要细菌性疾病。在日本，此前尚未报道L. petauri作为乳球菌病的病原，但已记录到无法归因于L. garvieae或L. formosensis的乳球菌病病例。这些细菌的特性、致病性和流行病学状况仍不清楚。研究人员回顾性检查了1978年至2021年间从日本患病养殖鱼类中分离的16株未鉴定乳球菌属（Lactococcus）分离株。基于7个管家基因（housekeeping genes）串联序列的系统发育分析中，所有分离株均聚类于L. petauri分支。多位点序列分析（Multilocus sequence analysis, MLSA）将这些分离株归为7个序列型（sequence types, STs），包括5个新序列型。两种先前报道的用于区分乳球菌属物种的多重PCR（multiplex PCR）检测未能准确鉴定这些L. petauri分离株。代表性分离株L20-09的腹腔注射（Intraperitoneal injection, i.p.）在黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）和条纹鲹（Pseudocaranx dentex）中诱导了剂量依赖性死亡。黄尾鰤的半致死剂量（median lethal dose, LD₅₀）值为5.20?×?10⁶ CFU/鱼，条纹鲹为1.16?×?10³ CFU/鱼。这些发现表明，致病性L. petauri早已存在于日本养殖鱼类中，并可能在常规诊断中被忽视。

**论文解读：日本养殖鱼类中Lactococcus petauri的回顾性鉴定、致病性与分子流行病学**

**1. 研究背景与问题**

乳球菌病（Lactococcosis）是由α-溶血性革兰氏阳性球菌引起的养殖鱼类重要细菌性疾病，全球范围内对水产养殖业造成显著经济损失。该病于20世纪70年代首次在日本养殖黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）中被确认为严重问题，随后Lactococcus garvieae被鉴定为病原。此后，在欧洲、美国及巴西的虹鳟、罗非鱼等养殖中相继报道。近年研究表明，除L. garvieae外，其近缘种L. formosensis和L. petauri也能引起鱼类乳球菌病。在日本，此前已报道两种乳球菌病原：L. garvieae（含血清型I和III）和L. formosensis（血清型II）。诊断实验室已开发出针对这三种血清型的凝集试验和多重PCR方法，用于物种和血清型鉴定及流行病学监测。然而，在多个县鱼类疾病诊断实验室保存的分离株中，存在一些无法通过现有诊断PCR方案鉴定的乳球菌属（Lactococcus）分离株，它们既不产生L. garvieae也不产生L. formosensis的特征性条带。同时，全球范围内已出现由这两种物种之外的乳球菌引起的乳球菌病报道。因此，这些未鉴定的分离株的身份、致病性及流行病学状况亟待阐明。本研究旨在确定这些存档分离株的物种身份，利用MLSA方案表征其序列型，并通过实验感染评估代表性分离株对黄尾鰤和条纹鲹（Pseudocaranx dentex）的致病性，以明确L. petauri是否参与了日本海水养殖鱼类的乳球菌病。

**2. 主要技术方法**

研究人员从日本三个县鱼类疾病诊断实验室和日本渔业研究与教育机构（Japan Fisheries Research and Education Agency）收集了16株无法通过常规PCR鉴定至物种或血清型水平的乳球菌属分离株（样本来源：1978-2021年期间从患病养殖鱼类中分离，包括黄尾鰤、条纹鲹、丝鳍单角鲀（Stephanolepis cirrhifer）、黑革鲀（Thamnaconus modestus）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）和红鳍东方鲀（Takifugu rubripes），来自海水或淡水养殖系统）。主要关键技术包括：（1）基于7个管家基因（als, atpA, tuf, gapC, gyrB, rpoC, galP）的串联序列系统发育分析（最大似然法和邻接法）进行物种鉴定；（2）多位点序列分析（MLSA）确定序列型（STs）和克隆复合体（CCs），并与PubMLST数据库中全球228株分离株的等位基因谱进行比较，构建网络图和Bray-Curtis距离分析；（3）分别评估两种已报道的多重PCR检测方法（Araki等, 2024；Ustaoglu等, 2024）对日本分离株的适用性；（4）通过腹腔注射实验感染，测定代表性分离株L20-09对黄尾鰤和条纹鲹的半致死剂量（LD₅₀），观察临床症状并重新分离细菌。

**3. 研究结果**

**3.1 基于系统发育分析的分离株鉴定**
通过7个管家基因串联序列构建的系统发育树（ML和NJ方法）显示，所有16株分离株均聚类于L. petauri分支，且该分支获得高支持值（UF-BS、SH-aLRT和BS均较高），支持可靠的物种水平鉴定。这表明这些未鉴定的分离株均为L. petauri。

**3.2 多位点序列分析**
16株分离株被归为7个不同的STs，包括2个已报道的STs（ST35和ST125）和5个新STs（ST185-ST189）。其中ST185含有两个新等位基因als-103和galP-84，ST187含有一个新等位基因atpA-70，ST188含有一个新等位基因gyrB-76。eBURST分析将ST187归入CC24（以ST24为创始者），ST125归入CC29，ST188归入CC10，其余STs为单态型（singletons）。基于Bray-Curtis距离的基因型组成分析显示，日本种群与地理邻近的东亚和东南亚种群相似度较高，且与南美种群也表现出相对较高的相似性，但与欧洲、非洲等远距离种群差异较大。网络分析表明，日本分离株的7个STs中无单一位点变异体（SLV）关系，且三个单态型STs位于网络的不同位置，提示日本种群并非源于单一引入事件。

**3.3 与先前报道的多重PCR检测的交叉反应性评估**
Araki等（2024）建立的多重PCR检测中，所有L. petauri分离株均未产生对应日本三种血清型（I-III）的条带，仅扩增出内部对照片段。Ustaoglu等（2024）建立的多重PCR检测中，16株L. petauri分离株有4株未扩增出L. petauri特异性条带，11株未扩增出L. garvieae和L. petauri共享的内部对照，且该检测未能检测到L. formosensis血清型II和L. garvieae血清型III的阳性对照。说明这两种多重PCR方法均不能准确鉴定日本L. petauri分离株。

**3.4 实验感染与致病性研究**
L20-09菌株（ST187）腹腔注射黄尾鰤和条纹鲹后，均出现剂量依赖性死亡。黄尾鰤的LD₅₀为5.20×10⁶ CFU/鱼，条纹鲹的LD₅₀为1.16×10³ CFU/鱼，条纹鲹对L. petauri的敏感性远高于黄尾鰤。死亡鱼表现出典型的乳球菌病临床症状，包括嗜睡、眼球充血和浑浊、胸鳍基部脓疱样病变、肝脏充血、鳃充血、心外膜炎和尾柄溃疡。从所有死亡鱼肾脏中均重新分离到纯培养的接种菌株，满足科赫法则（Koch's postulates）。

**4. 讨论与结论**

**讨论总结**：本研究证明L. petauri感染在日本可发生于四种海水养殖鱼类（丝鳍单角鲀、黑革鲀、条纹鲹、红鳍东方鲀），且最古老的分离株（NRIA-539）于1978年从日本鳗鲡中分离，表明L. petauri早在数十年前就与日本养殖鱼类疾病相关。实验感染证实L20-09对黄尾鰤和条纹鲹具有致病性，且条纹鲹更易感。ST187分离株（L19-69和L20-09）分别来自高死亡率的黑革鲀养殖场和条纹鲹，且ST187属于CC24，该克隆复合体在巴西罗非鱼养殖中引起过广泛暴发并具有高致病性，提示CC24可能包含全球分布的鱼源性致病性分离株。日本种群与东亚、东南亚及南美种群基因型组成相似，但无单一位点变异体关系，表明非单一引入。在临床诊断中，这些L. petauri分离株曾因常规PCR方法的局限性被误鉴定为L. garvieae，凸显了基于管家基因系统发育分析或全基因组序列相似性分析进行准确鉴定的必要性。两种多重PCR方法在本实验条件下对日本分离株的鉴定效果不佳，未来需评估其他分子诊断方法（如多重qPCR）的适用性，并开发简便、低成本的常规PCR用于常规筛查和流行病学监测。

**结论翻译**：本研究表明，来自日本患病养殖鱼类的存档乳球菌属分离株（此前未鉴定至物种水平）为L. petauri。MLST分析进一步表征了这些分离株，并提供了对未来流行病学研究有用的序列型信息。实验感染显示，代表性L. petauri分离株对黄尾鰤和条纹鲹具有致病性，表明该物种应被视为海水养殖鱼类乳球菌病的病原体。然而，本研究受限于检查的分离株数量、仅使用单一代表性菌株进行感染实验以及仅在两种鱼类中评估致病性。未来需要使用更大的分离株集合、更多鱼类物种以及经过验证的物种水平诊断方法进行进一步研究，以阐明L. petauri在水产养殖中的流行病学、宿主范围和致病性多样性。