通过整合生物信息学与实验分析鉴定环状RNA作为乳腺癌潜在的诊断和预后生物标志物

《Analytical Science Advances》：Identification of a Circular RNA as a Potential Diagnostic and Prognostic Biomarker in Breast Cancer Through Integrated Bioinformatic and Experimental Analyses

　　

乳腺癌（BC）具有复杂的分子亚型，导致一系列临床结局，仍然是全球女性发病和死亡的主要原因之一。这一挑战需要持续的研究以改善早期检测、治疗策略和患者预后。近期研究表明，环状RNA（circRNA）通过多种机制影响基因表达，特别是通过作为竞争性内源RNA（ceRNA）发挥作用。此外，许多circRNA已涉及多种肿瘤类型的起始和进展。然而，多种circRNA在特定癌症中的表达和功能角色仍很大程度上未被探索。在本研究中，研究人员分析了来自三个基因表达综合数据库（GEO）的circRNA表达数据，以鉴定与BC相关的候选circRNA。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）在24名BC患者的组织样本中验证候选circRNA。利用生物信息学分析，研究人员探究了这些circRNA的下游靶标微小RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA），以构建ceRNA调控网络。共鉴定出40个差异表达的circRNA，其中基于其新颖性和作为ceRNA的潜力，选择hsa_circ_0000231和hsa_circ_0011385，并构建了相应的ceRNA网络。RT-qPCR显示，与相邻非癌组织相比，hsa_circ_0000231在BC组织中显著上调。此外，基于生物信息学调查，预测了hsa_circ_0000231/hsa-miR-5683/细胞周期蛋白B1（cyclin B1）调控轴。通过跨数据集计算筛选与靶向实验验证和诊断准确性评估相结合，本研究提出了一个系统框架，用于将高通量RNA数据转化为具有潜在临床相关性的可量化生物标志物候选物。这些发现可能有助于识别BC中新的诊断和预后生物标志物。

乳腺癌（BC）是全球女性发病和死亡的主要原因之一，其复杂的分子亚型导致临床结局差异显著。尽管乳腺X线摄影改善了早期检测，但假阴性结果和辐射风险限制了其应用，组织活检仍是金标准，常导致晚期诊断。近期研究表明，环状RNA（circRNA）作为稳定存在的非编码RNA，通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制调控基因表达，在多种肿瘤中发挥促癌或抑癌作用。然而，circRNA在乳腺癌中的表达谱和功能机制尚未完全阐明，且高通量RNA数据的临床转化受限于不一致的筛选标准和实验验证不足。因此，研究人员开展了这项研究，旨在通过整合生物信息学与实验验证的系统框架，鉴定乳腺癌中具有诊断和预后潜力的circRNA生物标志物。该研究发表在《Analytical Science Advances》。

**主要技术方法**
研究人员采用跨数据集计算筛选策略，从基因表达综合数据库（GEO）获取三个微阵列数据集（GSE101123：8例BC组织+3例正常乳腺组织；GSE165884：4例BC组织+4例相邻非肿瘤组织；GSE182471：5例BC组织+5例相邻非肿瘤组织），使用ComBat函数校正批次效应后，利用Limma鉴定差异表达circRNA（DEcircRNA）。同时，从癌症基因组图谱（TCGA）乳腺癌浸润性癌（BRCA）项目获取miRNA-seq和RNA-seq数据（1078例肿瘤/104例正常对照，1091例肿瘤/113例正常对照），使用DESeq2鉴定差异表达miRNA（DEmiRNA）和mRNA（DEgene）。通过癌症特异性circRNA数据库（CSCD）预测circRNA-miRNA相互作用，结合miRTarBase和multiMiR预测miRNA-mRNA相互作用，构建ceRNA网络。在24对BC组织和相邻正常组织样本中（Babol医科大学2023年5月至2024年9月手术患者，未接受术前放化疗），采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证候选circRNA表达，使用GAPDH作为内参，2^-ΔΔCT法计算相对表达量。最后，通过GeneMANIA构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，clusterProfiler进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。

**研究结果**
**3.1 乳腺癌相关RNA的鉴定**
通过整合三个GEO数据集，研究人员鉴定出2522个DEcircRNA，其中40个满足校正后p<0.05且|log2FoldChange|>1的显著差异标准（31个上调，9个下调）。基于其新颖性、在乳腺癌中缺乏组织验证以及作为ceRNA的潜力，选择hsa_circ_0000231和hsa_circ_0011385作为候选circRNA。此外，从TCGA-BRCA数据中鉴定出76个DEmiRNA（48个上调，28个下调）和2831个DEgene（1620个上调，1211个下调）。

**3.2 乳腺癌中circRNA/miRNA/mRNA调控网络的构建**
利用CSCD预测，hsa_circ_0000231和hsa_circ_0011385分别靶向61个和59个miRNA。与TCGA中28个下调miRNA取交集后，hsa_circ_0000231获得1个FS-miRNA（hsa-miR-5683），hsa_circ_0011385获得1个FS-miRNA（hsa-miR-204-5p）。通过miRTarBase预测下游mRNA并与上调DEgene交集，hsa_circ_0000231获得13个FS-mRNA，hsa_circ_0011385获得35个FS-mRNA，其中RACGAP1和KCNK6为共同靶标。最终构建了包含2个circRNA、2个miRNA和46个mRNA的ceRNA调控网络。

**3.3 使用RT-qPCR验证候选circRNA**
RT-qPCR结果显示，与相邻非癌组织相比，hsa_circ_0000231在BC组织中显著上调（p=0.005，95%置信区间1.365–25.380），而hsa_circ_0011385无显著差异（p=0.637）。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，hsa_circ_0000231区分BC组织与正常组织的曲线下面积（AUC）为0.752（p<0.001），而hsa_circ_0011385的AUC为0.559（p=0.410）。Spearman相关性分析表明，hsa_circ_0000231表达水平与肿瘤分级（p=0.005）、T分期（p=0.034）和N分期（p=0.009）呈显著正相关。

**3.4 PPI和功能富集分析**
以hsa_circ_0000231相关FS-mRNA中p值最显著的细胞周期蛋白B1（CCNB1）为中心节点，通过GeneMANIA构建含21个节点和388条边的PPI网络，主要连接类型为物理相互作用（70.90%）。GO富集分析显示，生物过程（BP）主要富集于有丝分裂细胞周期相变、细胞周期G2/M相变和核分裂；细胞组分（CC）富集于周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物；分子功能（MF）富集于周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性。KEGG通路富集分析显示，相关基因主要富集于细胞周期、孕酮介导的卵母细胞成熟、细胞衰老和卵母细胞减数分裂等通路。

**总结讨论**
讨论部分指出，hsa_circ_0000231在多种癌症中表达上调，可通过海绵化hsa-miR-5683上调CCNB1，促进细胞周期G2/M相转换，从而发挥致癌作用。该研究首次在乳腺癌组织样本中验证了hsa_circ_0000231的过表达，并发现其与临床病理特征相关，支持其作为潜在生物标志物的价值。然而，hsa_circ_0011385在组织水平未显示显著差异，与先前细胞系研究结果不一致，可能源于体内外差异及样本量限制。未来需扩大样本量，结合双荧光素酶报告基因实验和体内外功能研究，以阐明该调控轴的分子机制。

**研究结论**
本研究应用了整合生物信息学与实验策略，以鉴定在BC中具有潜在诊断和预后相关性的circRNA。在候选者中，一个circRNA（hsa_circ_0000231）表现出一致性的过表达和肿瘤与正常组织之间的中等区分能力，支持其作为生物标志物的潜力。重要的是，本研究强调了一个结构化的分析框架，结合了多数据集筛选、候选优先排序、功能分析和实验验证，从而提高了生物标志物鉴定的可靠性。然而，未来需要涉及更大队列和功能研究的研究来验证这些发现并阐明所鉴定circRNA的生物学作用。此外，预测的hsa_circ_0000231/hsa-miR-5683/CCNB1调控轴值得进一步研究，这可能为BC肿瘤发生和进展的分子机制提供更深入的见解。