在GABA能中间神经元中条件性敲除Bassoon基因诱导的自闭症样行为

《Molecular Psychiatry》：Autism-like behavior induced by conditional ablation of the Bassoon gene in GABAergic interneurons

　　

突触功能障碍以及由此导致的兴奋性与抑制性传递失衡是自闭症谱系障碍（ASD）的基本方面。在此，研究人员利用在GABA能前脑中间神经元中条件性敲除突触前活性区支架蛋白Bassoon（Bsn）的小鼠，研究了抑制性突触障碍在ASD中的作用，Bassoon是突触发育、活动和维持的关键因子。条件性Bsn基因敲除导致受影响抑制性突触的突触小泡减少和突触效能降低，以及海马锥体神经元的GABA能抑制减弱。Bsn突变体还表现出体内海马突触网络的重组，表现为抑制性突触标记物的亚区特异性变化和小清蛋白（PV）中间神经元标记减少，最终导致海马网络活动模式紊乱和显著的线粒体及代谢失调。重要的是，突变小鼠出现了类似ASD的行为异常，包括广泛的社会行为缺陷、新奇诱导的过度觉醒伴有运动行为改变、焦虑增加和癫痫样活动。Bsn条件性敲除小鼠因此为GABA能突触在ASD相关行为和生理表型出现中的因果作用提供了有力证据。

自闭症谱系障碍（ASD）的核心特征包括突触功能障碍及兴奋/抑制（E/I）失衡。Bassoon（Bsn）蛋白是突触前活性区的关键支架蛋白，参与突触发育、维持及神经递质释放。人类BSN基因突变与ASD、智力障碍、癫痫等多种神经发育疾病相关。但全敲除Bsn的小鼠因严重表型无法精细分析行为缺陷，而兴奋性神经元条件性敲除（Bsn^Emx1cKO）未显示ASD样行为。鉴于抑制性突触在ASD中的重要性，研究人员建立了在GABA能中间神经元中条件性敲除Bsn的小鼠模型（Bsn^Dlx5/6cKO），旨在探究Bsn缺失对GABA能抑制的影响及其与ASD行为表型的关系。该研究发表在《Molecular Psychiatry》。

研究人员开展了从细胞到行为的多层次研究。主要关键技术方法包括：利用Tg(dlx5a-cre)1Mekk驱动Cre重组酶在GABA能前脑中间神经元表达，与Bsn^lx/lx小鼠杂交获得Bsn^Dlx5/6cKO小鼠；原代海马神经元培养结合免疫细胞化学和Synaptotagmin1抗体（Syt1Ab）摄取实验分析突触功能；急性脑片全细胞膜片钳和场电位记录检测突触传递及网络活动（γ振荡）；行为学测试（旷场、高架十字迷宫、明暗箱、三箱社交、新颖物体识别、巢穴构建、超声发声等）；海马组织蛋白质组学分析（由EMBL蛋白质组学核心设施完成）；Seahorse线粒体压力测试评估线粒体功能。

研究结果分为以下部分：

**Bassoon在部分GABA能突触的缺陷损害其突触前功能**
通过原代海马神经元培养和Syt1Ab摄取实验，研究人员发现Bsn^Dlx5/6cKO小鼠中约三分之一的GABA能突触缺失Bassoon，这些突触的VGAT和Synaptophysin1免疫荧光强度降低，突触小泡（SV）循环减少，且在基础及高钾诱导释放条件下Syt1Ab摄取均显著降低，表明Bassoon缺失的GABA能突触存在选择性突触释放缺陷。

**Bsn^Dlx5/6cKO小鼠海马显示抑制性和兴奋性突触密度的亚区特异性变化**
免疫组化分析证实Bsn^Dlx5/6cKO小鼠海马和纹状体中约30%的VGAT阳性突触缺乏Bassoon，且VGAT和Synaptophysin1在腹侧齿状回（DG）和CA3亚区的多个层次表达降低，而兴奋性突触标记物无显著变化，提示突触网络的亚区特异性重组。

**Bsn^Dlx5/6cKO小鼠表现出GABA能传递紊乱和网络活动改变**
急性海马脑片电生理记录显示，Bsn^Dlx5/6cKO小鼠腹侧CA1锥体神经元的微小抑制性突触后电流（mIPSC）频率显著降低，而幅度不变；兴奋性突触传递的基线和短时程可塑性改变（配对脉冲比增加），但长时程增强（LTP）正常。在胆碱能γ振荡实验中，CA3区γ峰值频率降低，且出现更多复发性癫痫样放电（REDs）。此外，腹侧海马锥体层中小清蛋白（PV）阳性中间神经元数量减少，PV免疫荧光强度降低，表明PV中间神经元功能异常。

**Bsn^Dlx5/6cKO小鼠表现出类似ASD的行为特征**
行为学测试揭示：Bsn^Dlx5/6cKO小鼠在旷场中表现出新奇诱导的过度活动（运动距离增加、头部转动角度增大），同时中央区探索减少提示焦虑样行为；明暗箱测试进一步证实焦虑样行为且独立于过度活动；社交行为方面，突变小鼠在社交新颖性测试中未能区分熟悉与陌生小鼠，表现出社交记忆缺陷，对异性尿液及雌鼠的探索减少，超声发声（USV）次数和时长显著降低；巢穴构建能力受损。这些行为异常与ASD核心症状高度一致。

**Bsn^Dlx5/6cKO小鼠显示线粒体活性的蛋白质组学和细胞生理学标志物增加**
海马蛋白质组学分析发现179种蛋白表达改变，上调蛋白主要富集于三羧酸（TCA）循环和呼吸电子传递通路，基因本体（GO）分析线粒体相关术语显著富集，包括多个ASD相关候选蛋白（如TMLHE、SLC25A20、ALDH1L2、VDAC）。免疫印迹验证了部分上调。Seahorse实验显示Bsn^Dlx5/6cKO原代神经元的基础呼吸、ATP产量、最大呼吸及质子漏均显著增加，提示线粒体过度活跃。与全敲除Bsn小鼠比较，线粒体变化相似，而兴奋性神经元条件性敲除（Bsn^Emx1cKO）无此现象，表明线粒体代谢失衡主要由GABA能突触Bsn缺失驱动。

讨论部分总结：Bassoon在GABA能（包括PV阳性）突触中作为关键的突触前协调因子，参与传递、蛋白稳态和代谢调控。Bsn^Dlx5/6cKO小鼠的抑制性突触缺陷导致海马网络重组、E/I平衡改变、PV中间神经元功能异常及线粒体代谢失调，最终引发ASD样行为。研究结论翻译为：总之，研究人员的发现表明，Bassoon在GABA能（包括PV阳性）突触中也扮演着传递、蛋白稳态和代谢的关键突触前协调因子角色，其缺失足以诱导ASD相关的行为和生理表型。