情境依赖性YEATS结构域抑制增强神经元韧性并改善肌萎缩侧索硬化症（ALS）表型

《Neurobiology of Disease》：Context-dependent YEATS-domain inhibition enhances neuronal resilience and improves ALS phenotypes

　　

神经退行性疾病中的神经元丢失部分由适应不良的应激信号传导和蛋白质毒性挑战下的适应受损所驱动。ENL和AF9是YEATS结构域的ε-N-酰基赖氨酸读取蛋白，主要在白血病中表征，但其在神经元中的功能仍不清楚。在此，研究人员利用互补的化学和遗传扰动定义了ENL/AF9 YEATS结构域的作用。研究人员在分化的人类神经元中应用选择性YEATS抑制剂SR-0813，并利用SR-0813或ENL/AF9敲低在果蝇（Drosophila）中调节ENL/AF9活性。在果蝇中，SR-0813通过延长寿命和增强应激耐受性模拟了ENL/AF9敲低的效果。为了测试疾病情境特异性，研究人员在神经退行性疾病模型中进行了果蝇遗传修饰筛选。ENL/AF9减少在UBQLN2P497H和SOD1G94A中是有益的，但在慢性聚集体或线粒体应激模型如(GGGGCC)49和多聚谷氨酰胺（polyQ）疾病中疗效降低或变得有害。在人类神经元中，SR-0813在多种应激条件下改善了存活率，在内质网（ER）应激期间保护最强。在机制上，ENL/AF9 YEATS抑制减弱了PERK依赖的整合应激反应（ISR）信号传导，并在不广泛增强蛋白质稳态（proteostasis）能力的情况下减少了凋亡承诺。总之，这些发现确定ENL/AF9为神经元应激反应动力学的调节因子，并确立了ENL/AF9 YEATS结构域抑制作为一种增强神经元韧性的情境依赖性策略，与ALS及相关蛋白质毒性障碍相关。

研究背景方面，神经元身份与功能依赖于需长期稳定维持且能对生理病理刺激动态响应的转录程序，染色质调控是神经元发育、可塑性及控制塑造神经元韧性与易感性的应激响应转录程序的关键层，但调节这些应激程序的特定染色质读取模块及其对选择性化学扰动的可及性仍不明确。YEATS结构域家族染色质读取蛋白作为组蛋白ε-N-酰基赖氨酸修饰的选择性传感器，通过连接染色质状态与转录输出发挥作用，其中ENL（MLLT1）及其旁系同源物AF9（MLLT3）在转录延伸复合物包括超级延伸复合物（SEC）中发挥功能，YEATS结构域依赖的染色质结合促进RNA聚合酶II暂停释放并放大刺激响应基因表达，组蛋白酰化通过酰基辅酶A可用性紧密偶联细胞代谢，使YEATS结构域识别成为代谢状态转化为转录响应的潜在机制，但这些特征在增殖系统尤其是癌症中被广泛研究，YEATS结构域蛋白是否在分裂后神经元中调节应激适应仍大部分未被探索。果蝇编码单一ENL/AF9直系同源物ear（下称dENL/AF9），含保守YEATS结构域并参与相关染色质关联复合物，既往研究发现dENL/AF9遗传减少延长寿命并增强氧化应激耐受性，指向其在机体韧性中的作用，且其他YEATS结构域蛋白如果蝇YEATS2同源物扰动产生不同神经元表型，表明该蛋白家族功能特异性，由此提出dENL/AF9可能通过YEATS依赖转录机制调节神经元应激反应。SR-0813是选择性ENL/AF9 YEATS结构域小分子抑制剂，作为染色质竞争性配体阻断YEATS结构域与组蛋白酰赖氨酸标记结合，破坏ENL/AF9依赖转录程序，选择性高于YEATS2或GAS41等其他YEATS结构域蛋白，可用于研究该通路。该研究结合果蝇与人类神经元模型的化学与遗传方法，定义ENL/AF9 YEATS结构域功能如何在不同生理与疾病相关情境中塑造神经元应激适应，论文发表于《Neurobiology of Disease》。

主要关键技术方法包括使用果蝇（Drosophila melanogaster） Oregon R品系及携带GAL4驱动、UAS-RNAi及神经退行疾病模型转基因的品系，人类成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞经视黄酸（RA）分化为神经元样细胞；通过果蝇寿命与氧化应激测定、DHE染色检测脑活性氧（ROS）、眼部变性修饰筛选、幼虫爬行与成虫负趋地性测定、神经肌肉接头（NMJ）免疫染色，细胞MTT活力测定、CM-H₂DCFDA检测ROS、Annexin V/PI流式细胞术分析凋亡坏死、Western blotting与定量RT-PCR等技术开展研究，所有果蝇实验均经六次回交消除遗传背景效应，细胞实验经机构生物安全委员会批准。

研究结果部分，3.1 SR-0813促进果蝇长寿与氧化应激抵抗且无内在自由基清除活性，通过对20日龄果蝇饲喂SR-0813（1或10μM）进行Kaplan–Meier生存分析显示显著延长寿命，预处理10日后经过氧化氢（H₂O₂）暴露24小时存活率部分挽救，应激后给药在恢复期降低累积死亡率，ABTS与DPPH assay显示SR-0813无自由基清除活性，表明其模拟dENL/AF9减少的表型通过非直接抗氧化机制的转录重编程实现。3.2 SR-0813增强分化人类神经元应激韧性并在ER与蛋白毒性应激下减弱凋亡，RA分化SH-SY5Y细胞经H₂O₂、MG132、衣霉素（Tm）、鱼藤酮处理并共处理SR-0813，MTT显示Tm下从0.1μM起存活增强最显著，MG132下0.4–1.6μM峰值保护，H₂O₂下仅10μM有益，鱼藤酮下加重毒性；Annexin V/PI流式显示Tm下SR-0813剂量依赖增加活细胞、减少晚期凋亡与坏死，MG132下轻度增加活细胞并减少早期凋亡，表明最强保护在ER应激下通过衰减凋亡实现。3.3 SR-0813减弱ROS积累并下调ER应激、ISR与凋亡信号，未分化与分化SH-SY5Y细胞经Tm与SR-0813共处理，CM-H₂DCFDA成像与流式显示ROS水平剂量依赖降低；Western blotting显示GRP78/BiP不变，ERO1L在1.6μM降低，ATF6不变，PERK–ISR轴ATF4与磷酸化eIF2α/total eIF2α比值降低，CHOP降低，Bax/Bcl-2比值降低，聚泛素化（poly-Ub）物种减少，VCP与UBQLN2不变；MG132下VCP与UBQLN2不变，poly-Ub轻度减少，CHOP与Bax/Bcl-2降低，表明SR-0813减少ER应激相关氧化应激与PERK-ISR信号，限制凋亡承诺并减少蛋白毒负担而不广泛改变所检蛋白质稳态因子。3.4 ENL/AF9调节在神经退行模型中具情境依赖性并对UBQLN2相关病理有选择性影响，GMR-GAL4驱动眼表达人类神经退行病基因并伴dENL/AF9敲低，评分显示UBQLN2^P497H视网膜变性强抑制，TDP-43^Q331K与(G₄C₂)₄₉轻度改善，ATXN1-polyQ₈₂与HTT-polyQ₁₂₈毒性加剧；elav-GAL4泛神经元表达UBQLN2^P497H伴dENL/AF9敲低，25°C下早期爬升表现改善，28°C下更持续改善，表明ENL/AF9调节神经元应激与易感性具情境依赖性，对UBQLN2病理有选择性保护。3.5 SR-0813改善果蝇UBQLN2-ALS模型神经元功能障碍与应激信号，elav>UBQLN2^P497H果蝇从发育早期饲喂SR-0813，三龄幼虫爬行路径长度、距离与速度增加，NMJ分支长度与突触扣结（bouton）数增加；15日龄成虫脑DHE染色显示ROS荧光强度与ROS指数降低，HA-UBQLN2蛋白水平不变；头裂解液Western blotting显示果蝇ATF4（Crc）、磷酸化eIF2α降低，自噬适配体Ref(2)P与poly-Ub物种剂量依赖降低，表明药理抑制重现遗传保护，改善神经元功能并衰减氧化与ER应激信号。3.6 SR-0813差异调节果蝇ALS模型成虫爬降，elav表达UBQLN2^P497H、SOD1^G94A、TDP-43^Q331K、(G₄C₂)₄₉并纵向测爬升，UBQLN2^P497H全程改善，SOD1^G94A15日后显著改善，TDP-43^Q331K后期轻度改善，未防20日后死亡，(G₄C₂)₄₉随年龄加重衰退，表明药理ENL/AF9抑制效果跨ALS模型不同，支持该通路调节神经元易感性具疾病情境依赖性。

讨论部分总结，ENL/AF9 YEATS结构域蛋白为染色质读取蛋白，其在神经元应激适应中作用大多未被探索，基于dENL/AF9耗竭延长果蝇寿命与改善应激耐受性，SR-0813在体内表型模拟dENL/AF9敲低，支持ENL/AF9在机体水平塑造应激韧性的保守作用。SR-0813无细胞游离自由基清除活性，其降ROS可能为YEATS抑制重塑应激信号的间接效应；在细胞模型中减弱PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴并减凋亡输出，不广泛阻止未折叠蛋白反应（UPR）诱导或改变所检蛋白质稳态因子，主要调节应激反应信号而非全局增蛋白质稳态能力，与UBQLN2相关ALS模型中减轻ISR过度参与一致。YEATS抑制与遗传敲低并行表型表明可通过干扰读取功能急性或减表达慢性调节ENL/AF9活性。ENL/AF9抑制具情境依赖性，ER应激中最保护，在线粒体应激与polyQ或GGGGCC重复扩展模型中疗效减甚至有害，反映响应取决于广泛细胞应激景观而非单一致病机制，可能与应激信号幅度、时长、背景及下游后果有关，急性ER应激下调PERK/eIF2α/ATF4限适应不良转录与凋亡，慢性聚集体或线粒体病需持续应激响应转录维持蛋白质稳态与线粒体适应，抑制则不利。该发现补充既往UPR/ISR药理调节剂如PERK抑制剂、ISRIB、延长eIF2α磷酸化化合物，SR-0813通过ENL/AF9依赖转录调节上游作用而非直接调翻译控制，或代表选择性调节应激响应转录以重塑ALS相关适应不良ISR输出的替代策略。ENL/AF9在转录延伸复合物中通过YEATS结构域识别组蛋白酰赖氨酸促进RNA聚合酶II暂停释放放大转录，组蛋白酰化代谢敏感，ENL/AF9或将代谢与应激染色质状态偶联至适应转录程序幅度与持久性，抑制调节应激诱导转录响应幅度与持久性，生物学效应由潜在应激情境决定。其他YEATS读取蛋白如YEATS2参与核糖体与代谢基因表达，耗竭致果蝇神经元应激与行为缺陷，维持基础生物合成能力，表明神经元中YEATS读取蛋白特化，YEATS2保障核心生物合成程序，ENL/AF9调节应激响应基因幅度。研究扩展ENL/AF9生物学角色，确立YEATS结构域抑制为调节神经元应激适应的手段，ENL/AF9抑制在PERK依赖ISR信号适应不良时最有效，治疗潜力取决于潜在应激情境，界定可有利偏移的应激条件与疾病设置对评估其在神经退行性疾病中潜力至关重要。研究局限包括未直接量化SR-0813在果蝇或哺乳类的靶标占用与药代动力学，机制工作在RA分化SH-SY5Y与果蝇神经元，需扩展至人iPSC来源运动神经元与哺乳ALS模型，聚焦定义ISR、蛋白质稳态与凋亡标记而未全基因组染色质或转录组分析，未检年龄依赖性神经元衰老是否贡献ENL/AF9抑制的情境依赖性疗效。

研究结论部分翻译为：ENL/AF9 YEATS结构域蛋白是染色质读取蛋白，其在神经元应激适应中的作用大多未被探索。基于研究人员此前发现dENL/AF9耗竭延长果蝇寿命并改善应激耐受性，研究人员将这些表型作为基准，测试选择性YEATS抑制剂SR-0813是否引发相似机体结局，与果蝇中ENL/AF9通路的功能参与一致。在体内，SR-0813模拟了dENL/AF9敲低的关鍵方面，在生命后期给药延长寿命，增强氧化挑战抵抗性，并改善UBQLN2连锁ALS模型中的运动衰退与神经肌肉接头缺陷。这些汇聚的遗传与药理数据显示ENL/AF9在机体水平塑造应激韧性具有保守作用，并推动在神经元模型中进行更深入的机制研究。SR-0813在细胞游离assay中无可测自由基清除活性，表明其在细胞与体内降ROS效应可能源于YEATS抑制重塑应激信号的间接结果。在细胞模型中，SR-0813减弱PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴并减少凋亡输出，而不广泛阻止未折叠蛋白反应诱导或改变所检蛋白质稳态因子。这些发现表明SR-0813主要调节应激反应信号而非全局增加蛋白质稳态能力，与其在UBQLN2连锁ALS模型中减轻变性一致，该模型中毒性与ISR过度参与放大相关。YEATS抑制与遗传敲低产生的并行表型进一步表明，ENL/AF9活性可通过不同模式调节，即通过破坏读取功能急性调节或通过减少表达慢性调节，突显未来使用正交YEATS配体或ENL定向降解策略更全面定义ENL/AF9在神经元情境中功能的研究机会。ENL/AF9抑制的一个显著特征是具情境依赖性。SR-0813在急性ER应激中最具保护性，而在慢性疾病模型中其疗效降低甚至有害，包括鱼藤酮诱导的线粒体应激与多聚谷氨酰胺或GGGGCC重复扩展相关的神经退行。这些发现表明对ENL/AF9抑制的响应取决于广泛细胞应激景观而非单一致病机制。重要的是，这些疾病模型在ISR激活方面并非互斥，例如ISR信号也参与GGGGCC重复扩展毒性，包括通过eIF2α磷酸化依赖的RAN翻译调节。相反，分歧响应可能反映应激信号的幅度、持续时间、细胞情境及下游后果的差异。在急性ER应激条件下，减弱PERK/eIF2α/ATF4信号可限制适应不良转录程序与凋亡。反之，慢性聚集体或线粒体相关疾病可能需持续应激响应转录以维持蛋白质稳态、线粒体功能与细胞适应，使ENL/AF9抑制较不有利。这种平衡对聚集倾向蛋白尤其相关，其毒性强烈受分子伴侣可用性与清除途径塑造，对线粒体应激亦然，需持续补偿程序维持生物能量稳态。因此，这些发现补充了既往使用UPR/ISR药理调节剂的研究，包括PERK抑制剂、eIF2B激活剂如ISRIB及延长eIF2α磷酸化的化合物。尽管这些试剂在选定疾病模型中显示神经保护效应，其疗效跨实验情境各异，且在某些情况下受限于机制相关毒性或广泛操纵应激反应信号的不良影响。与这些方法不同，SR-0813通过ENL/AF9依赖转录调节上游作用而非直接调节翻译控制。尽管底层转录机制待定义，这些发现提出选择性调节应激响应转录或可代表在ALS相关情境中重塑适应不良ISR输出的替代策略。该解释与ENL/AF9在转录延伸复合物中的既定分子功能一致，其中YEATS结构域依赖的组蛋白ε-N-酰基赖氨酸标记识别支持RNA聚合酶II暂停释放与放大刺激响应转录。在此模型中，酰赖氨酸识别促进ENL/AF9含延伸复合物的位点特异性招募与稳定，从而增加转录输出。由于组蛋白酰化代谢敏感，ENL/AF9或将代谢与应激诱导染色质状态偶联至适应转录程序的幅度与持久性。因此研究人员提出ENL/AF9抑制调节应激诱导转录响应的幅度与持久性，所得生物学效应由底层应激情境决定。值得注意的是，其他YEATS结构域读取蛋白似乎支持不同神经元转录功能；例如YEATS2作为ATAC组蛋白乙酰转移酶复合物的读取亚基，涉及核糖体与代谢基因表达，其耗竭致果蝇神经元应激与行为缺陷，与维持基础生物合成能力的作用一致。据此，数据支持神经元中YEATS读取蛋白特化的模型，YEATS2保障核心生物合成程序，ENL/AF9调节应激响应基因幅度。总体而言，研究发现扩展ENL/AF9超越转录调节的生物学作用，并确定YEATS结构域抑制为调节神经元应激适应的手段。综上，数据表明ENL/AF9抑制在PERK依赖ISR信号变得适应不良时最有效，强调其治疗潜力可能取决于底层应激情境。界定可有利偏移该平衡的应激条件与疾病设置，对评估ENL/AF9抑制在神经退行性疾病中的治疗潜力至关重要。本研究有几个局限指向重要后续步骤。首先，尽管SR-0813是表征良好的染色质竞争性ENL/AF9 YEATS抑制剂，研究人员未在果蝇或哺乳系统直接量化其靶标占用或药代动力学，需更详细暴露与占据测量以优化给药窗口。其次，机制工作在RA分化SH-SY5Y细胞与果蝇神经元进行；将这些发现扩展至人iPSC来源运动神经元与哺乳ALS模型对检验所观察情境依赖性效应的普遍性与转化相关性很重要。最后，聚焦于定义ISR、蛋白质稳态与凋亡标记，未进行全基因组染色质或转录组分析，故ENL/AF9调节的应激反应程序全谱待绘制。也未检查年龄依赖性神经元衰老是否贡献果蝇ALS模型中对ENL/AF9抑制的情境依赖性疗效。确定衰老是否影响SR-0813跨ALS模型的情境依赖性疗效是未来研究的重要方向。