用于定量血清中BUB1抑制剂BAY-1816032的紫外、直接荧光和RP-HPLC-FLD分析方法的光谱表征与开发

《Results in Chemistry》：Spectral characterization and development of UV, direct fluorescence, and RP-HPLC-FLD assays for quantifying the BUB1 inhibitor BAY-1816032 in serum to support preclinical development

　　

BAY-1816032是一种选择性BUB1激酶抑制剂（BUB1 kinase inhibitor），在癌症治疗中日益重要，但此前尚无快速或易用的分析方法用于其在生物基质中的测定。在此，研究人员提供了BAY-1816032的首个全面光谱和光物理表征，并建立了三种互补的分析方法——紫外分光光度法（UV spectrophotometry）、直接荧光法（direct fluorescence）以及反相高效液相色谱-荧光检测法（RP-HPLC-FLD）——用于其在血清中的定量。该化合物在310–330?nm处显示清晰的吸收带，并具有内在荧光，发射最大值接近362?nm，可实现直接、无需提取的荧光测定。在稀甲酸中，发射峰移至约480?nm，这一特性被用于灵敏的HPLC-荧光检测（激发315?nm/发射480?nm）。在胎牛血清中的校准（0.5–10?μM）表明，直接荧光法比紫外-可见分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）具有显著更高的灵敏度（检测限LOD 0.39?μM vs. 3.92?μM）。RP-HPLC-FLD提供了最高的分析性能（LOD 0.14?μM；定量限LOQ 0.48?μM）。各方法所需样品体积差异很大：NanoDrop UV仅需1–2?μL，RP-HPLC-FLD使用5?μL浓缩处理样品，而直接荧光法需要100?μL血清。BAY-1816032表现出强蛋白结合，在色谱分析前需20% DMSO进行定量释放，而直接荧光法完全避免了提取步骤。总之，这些方法为BAY-1816032提供了首个分析框架，并支持其在制剂研究、药代动力学分析和更广泛的临床前开发中的应用。

**论文解读：BUB1抑制剂BAY-1816032的血清定量分析方法开发与光谱表征**

**研究背景与问题**
BUB1（budding uninhibited by benzimidazole 1）有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶是染色体分离的核心调控因子，其异常信号与多种恶性肿瘤（如子宫内膜癌、结直肠癌、小细胞肺癌、骨肉瘤及恶性胸膜间皮瘤）的发生发展密切相关。BAY-1816032是一种口服生物可利用的强效BUB1抑制剂，在乳腺癌、小细胞肺癌等模型中表现出化疗增敏和放疗增敏作用，并已通过CRISPR-Cas9筛选被鉴定为恶性胸膜间皮瘤的可药物靶点。然而，此前BAY-1816032的定量仅依赖质谱（LC-MS/MS）方法，成本高、需专门设备，且缺乏对其光谱和光物理性质的表征，限制了制剂开发、药代动力学建模和常规监测研究的推进。因此，开发快速、易用、低成本的分析方法对于支持该化合物的临床前开发至关重要。

**研究概述**
研究人员在本文中首次系统表征了BAY-1816032的紫外-可见吸收和荧光光谱特性，并基于此建立了三种互补的血清定量方法：紫外分光光度法（UV spectrophotometry）、直接荧光光谱法（direct fluorescence）和反相高效液相色谱-荧光检测法（RP-HPLC-FLD）。研究结果表明，直接荧光法具有高灵敏度（LOD 0.39?μM）且无需样品提取，而RP-HPLC-FLD提供了最佳分析性能（LOD 0.14?μM，LOQ 0.48?μM）。该研究为BAY-1816032的分析提供了首个非质谱框架，支持其在制剂研究、药代动力学谱分析和临床前开发中的应用。论文发表在《Results in Chemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用胎牛血清（FBS）作为生物基质，通过以下技术建立方法：（1）紫外-可见分光光度法（NanoDrop? One）测定血清中BAY-1816032的吸光度，校准范围0.5–10?μM，检测波长320?nm；（2）直接荧光光谱法（Varioskan? FLASH多模式读板仪）在激发320?nm/发射362?nm条件下直接测定血清中的荧光强度，无需样品预处理；（3）反相高效液相色谱-荧光检测（Agilent 1290 Infinity II，Poroshell 120 EC-C18色谱柱，4.6?×?100?mm，2.7?μm），使用含0.1%甲酸的流动相（水-乙腈梯度），激发315?nm/发射480?nm，进样体积5?μL。样品前处理包括20% DMSO预处理以释放蛋白结合的药物，随后用乙腈沉淀蛋白并过滤。

**研究结果**
**3.1 光谱与光物理性质**
通过紫外-可见分光光度法在DMSO中测得BAY-1816032在260–350?nm有强吸收，最大吸收波长（λ_max）约313?nm；在血清中红移至约320?nm。荧光光谱显示激发在300–340?nm时，发射峰在330–430?nm，最大发射波长（λ_em）约362?nm。以2-氨基蒽为参比计算得DMSO中量子产率为0.30，表明该化合物为中等荧光物质。

**3.2 紫外分光光度法测定血清中BAY-1816032**
在血清中直接测定（无提取）0.5–10?μM浓度范围的吸光度，在320?nm处构建校准曲线，线性良好（R² = 0.9979），但灵敏度较低，检测限（LOD）为3.92?μM，定量限（LOQ）为11.89?μM，信噪比（SNR）仅1.77。

**3.3 荧光法定量血清中BAY-1816032**
在激发320?nm/发射362?nm条件下直接测定血清中荧光强度，校准曲线线性良好（R² = 0.9933），灵敏度显著优于紫外法，LOD为0.39?μM，LOQ为1.17?μM，SNR达28.21，表明无需样品提取即可实现高灵敏度检测。

**3.4 提取与回收率验证**
初始乙腈沉淀蛋白后未检测到BAY-1816032信号，提示强蛋白结合。通过三条件实验（滤器结合对照、基质干扰对照、全流程提取）优化，发现20% DMSO预处理可有效释放药物，回收率约90%，日内精密度RSD <5%。

**3.5 RP-HPLC-FLD法测定血清中BAY-1816032**
在含0.1%甲酸的流动相中，BAY-1816032发射峰红移至约480?nm。优化后色谱条件：激发315?nm/发射480?nm，保留时间约4.21?min，校准范围1–8?μM，线性极佳（R² = 0.9999），LOD为0.14?μM，LOQ为0.48?μM，为三种方法中灵敏度最高者。

**3.6 绿色度与实用性**
直接荧光法获得最高AGREE绿色度评分（0.91），因其无需提取、无有机溶剂、高通量（96孔板）；紫外分光光度法评分为0.85，优势在于试剂-free和超低体积（1–2?μL）；RP-HPLC-FLD评分0.58，因需有机溶剂和较高能耗，但灵敏度与选择性最优。

**讨论与结论**
讨论部分指出，BAY-1816032的强蛋白结合是影响回收率的关键因素，20% DMSO预处理是LC方法中定量释放的必要条件，而直接荧光法完全避免了此问题。三种方法各具互补优势：直接荧光法适用于快速、低成本、高通量筛查；紫外分光光度法适用于高浓度快速检测；RP-HPLC-FLD适用于需要最高灵敏度和特异性的药代动力学研究。研究结论部分翻译如下：
我们建立了三种互补的分析方法——紫外分光光度法、直接荧光法和RP-HPLC-FLD——用于定量血清中BAY-1816032。每种方法在成本和分析性能之间提供了不同的平衡：荧光法提供了快速、溶剂-free且高灵敏度的选择；紫外分光光度法简单、低成本，适用于较高浓度范围；RP-HPLC-FLD则为详细药代动力学工作提供了最大灵敏度和特异性。这些稳健的方法共同支持了BAY-1816032在多种临床前应用中的灵活、可靠测量。