《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Intelligent Monitoring of Biosynthesized HMOs: Universal Viable Bacteria and DNA Detection Technologies
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摘要人乳低聚糖是母乳中第三大固体成分，通过调节肠道微生物群、调控免疫功能以及促进神经发育，对婴儿健康具有重要意义。合成生物学与代谢工程领域的进展使得人们能够利用经过改造的大肠杆菌等微生物作为宿主，通过发酵大规模生产人乳低聚糖。虽然这种方法提高了生产效率，但也引发了关于最终产品中残
摘要
人乳低聚糖是母乳中第三大固体成分，通过调节肠道微生物群、调控免疫功能以及促进神经发育，对婴儿健康具有重要意义。合成生物学与代谢工程领域的进展使得人们能够利用经过改造的大肠杆菌等微生物作为宿主，通过发酵大规模生产人乳低聚糖。虽然这种方法提高了生产效率，但也引发了关于最终产品中残留的工程化微生物和外源DNA的生物安全问题。此外，发酵液的高粘度及复杂性也给现场质量检测带来了困难。本综述介绍了当前用于检测人乳低聚糖生产系统中存活细菌及残留遗传物质的各种分析方法，重点探讨了代谢活性检测、核酸扩增、生物传感平台以及人工智能辅助分析技术。文中分析了这些技术在复杂发酵环境中的性能、实际应用情况以及现有局限性，同时还介绍了微流控技术、可编程核酸酶以及机器学习技术整合后带来的新机遇。
引言
20世纪初，人们发现人乳中的非乳糖类碳水化合物与婴儿存活率相关，这一发现为后来的人乳低聚糖研究奠定了基础[1]。1954年，人们首次分离出了2’-岩藻半乳糖和3-岩藻半乳糖[2]。如今，人乳低聚糖已是人类母乳中第三大固体成分。它们由五种单糖——D-半乳糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸——构成，共有200多种结构各异的糖类存在[3]。这类糖类可通过促进有益肠道菌群生长、维持肠道屏障功能、调控免疫系统以及助力神经发育来保障婴儿健康[4]。正因为具有这些益处，美国食品药品监督管理局、欧洲食品安全局以及中国国家卫生健康委员会已批准多种人乳低聚糖（如2’-FL和LNnT）用于婴儿配方奶粉中[5]、[6]。
近年来，代谢工程与合成生物学领域的进步使得人乳低聚糖的生产方式从化学合成转变为微生物发酵。由于大肠杆菌菌株的遗传结构清晰且易于大规模生产，因此被广泛用于人乳低聚糖的制造过程，常见的菌株包括BL21(DE3)、MG1655和K-12 DSM 4235等[7]、[8]。尽管发酵工艺提升了产量并提高了生产的可行性，但也引发了关于残留活菌及外源DNA的生物安全担忧[9]。现行法规要求对这些物质进行严格控制：美国食品药品监督管理局和欧洲食品安全局禁止在最终产品中检测到活的生产菌株，而中国国家卫生健康委员会则规定肠道杆菌的数量不得超过10 CFU/g。根据世界卫生组织的规定，外源DNA的残留量通常需控制在10 ng/g（或ng/mL）以下[6]。这些规定凸显出在人乳低聚糖生产全过程中进行可靠监测的必要性。
由于发酵液浓度高且成分复杂，传统检测方法在安全性评估过程中常常会受到严重干扰。因此，目前的检测策略正逐渐从耗时的培养法转向快速便捷的生物传感技术。本综述旨在通过通用检测技术为人乳低聚糖的安全监测提供新的方法，重点介绍存活细菌代谢检测、核酸扩增、信号转导、集成生物传感器以及人工智能辅助分析技术。其中特别关注了可编程核酸酶（CRISPR/Cas和Argonaute）与微流控装置、侧向流检测技术的结合在实现现场检测方面的应用。结合人工智能辅助的信号分析，这些技术能够提升人乳低聚糖生物制造的灵敏度、自动化水平以及可追溯性（见图1）。
章节节选
人乳低聚糖的功能特性与生物合成机制
新生儿出生时免疫系统尚未完全发育，他们很大程度上依赖母乳中的生物活性成分，包括抗体、细胞因子以及人乳低聚糖，来获得免疫保护并促进免疫系统发育。人乳低聚糖属于复杂的糖类，其还原端以乳糖为核心结构，再通过多种糖苷键与不同的单糖相连而形成更长链结构[10]。根据结构差异，人乳低聚糖可分为三类：中性核心型、岩藻糖修饰型和唾液酸修饰型[11]。
存活细菌的检测技术
目前人们普遍使用经过改造的大肠杆菌菌株来大量生产人乳低聚糖。但即便经过彻底的下游纯化处理，仍可能存在细胞残留，进而带来内毒素风险[48]。因此，检测残留的存活细菌对于满足相关法规要求以及确保产品安全至关重要。不过，人乳低聚糖生产环境中含有大量糖类，且成分极为复杂，这给存活细菌的检测带来了很大难度。可靠的检测方法需要能够依据特定特征区分存活细菌与其他物质。
DNA分子层面的检测技术
世界卫生组织已经制定了生物制品中宿主DNA残留量的标准，因此检测外源DNA对于评估人乳低聚糖的安全性而言十分重要。现有的检测方法既可以检测来自裂解细胞的细胞内DNA，也可以检测生产体系中的游离DNA片段。在样品预处理之后，会通过核酸扩增技术富集低丰度的目标序列，随后再利用CRISPR/Cas和Argonaute等可编程核酸酶进行序列特异性检测（见图4）。这样的检测方式有助于更准确地比较不同样本的情况。
便携式检测平台
近年来，即时检测技术的发展方向是从独立的检测装置转向集成型的“从样品到结果”一体化平台，这类平台能够将样品前处理、分子识别以及自动分析功能整合在同一个工作流程中。这一转变反映了在复杂工业环境中人们对快速、分布式检测需求的不断增长。侧向流检测技术可以实现快速可视化筛查，而微流控装置则可将流体操控与多重检测功能整合到体积较小的设备中。人工智能技术更是进一步提升了这些检测平台的性能。
总结与展望
本综述系统总结了在复杂体系中检测存活细菌及残留外源DNA的分析策略，为生物合成人乳低聚糖的生物安全评估提供了参考。传统的平板计数法仍是检测存活细菌的参考标准，但该方法耗时且劳动强度较高。基于活性的检测方法虽能实现快速筛查，但往往缺乏足够的特异性，而基于核酸的检测方法则能够实现物种特异性的检测。
作者贡献说明
刘婷：原文撰写。 王欣：文章审阅与编辑。 李云毅：文章审阅与编辑。 刘鹏路：文章审阅与编辑。 程楠：文章审阅与编辑、项目监督、项目管理以及资金筹集工作。
利益冲突声明
所有作者均声明，自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关联或个人关系。
致谢
我们衷心感谢中国自然科学基金（项目编号：32472424）以及中国农业大学2115人才发展计划的支持。
Ting Liu|Xin Wang|Yunyi Li|Penglu Liu|Nan Cheng
中国农业大学食品科学与营养工程学院北京食品质量与安全实验室，北京，100083，中国
