金琥（Echinocactus grusonii）及其相关内生真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）在神经保护中的治疗潜力：体外和计算机模拟研究

《Scientific Reports》：Therapeutic potential of Echinocactus grusonii and its associated endophytic fungus Aspergillus oryzae in neuroprotection: in vitro and in silico investigations

　　

金琥（Echinocactus grusonii，同义名Kroenleinia grusonii）原产于墨西哥，在园艺学中广为人知，但其化学成分研究尚不充分。研究人员检测了金琥的刺及其内生真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）的化学特征和神经保护潜力。与茎相比，刺中含有显著更高水平的酚类物质（293 mg没食子酸/g干重提取物）、黄酮类物质（132 mg槲皮素/g干重提取物）和生物碱（14.5 mg阿托品/g干重提取物）。非靶向代谢组学（UPLC-HRMS/MS）初步鉴定出刺中有27种代谢物，真菌提取物中有14种代谢物。两种提取物均表现出对乙酰胆碱酯酶（AChE）和β-分泌酶（BACE-1）的强效剂量依赖性抑制。刺提取物对AChE的IC₅₀值为0.362 μg/mL，对BACE-1的IC₅₀值为0.425 μg/mL，而真菌提取物对AChE更有效（IC₅₀ = 0.255 μg/mL）。对所有鉴定出的化合物进行了计算机模拟对接，得分最高的候选化合物的分子动力学模拟显示与靶酶存在稳定的相互作用。这些发现突显了金琥的刺及其相关内生菌作为神经退行性疾病管理的有前景的双靶点神经保护来源。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其病理机制涉及乙酰胆碱耗竭、细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块积累和tau蛋白聚集。乙酰胆碱酯酶（AChE）和β-分泌酶（BACE-1）是AD发病机制中的关键酶：AChE水解乙酰胆碱，BACE-1催化Aβ产生的限速步骤。因此，抑制AChE和BACE-1是当前AD管理的核心策略，也适用于青光眼、重症肌无力及神经损伤等其他治疗领域。仙人掌科植物（如金琥）及其内生真菌是潜在生物活性代谢物的未充分开发来源。金琥（Echinocactus grusonii）原产墨西哥，其茎部先前研究已分离出具有神经保护活性的化合物，但其刺及内生真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）的化学组成和神经保护潜力尚待系统研究。本研究旨在通过比较金琥刺与内生真菌的化学特征及神经酶抑制活性，拓展对双靶点神经保护来源的认识。

**研究内容与结论**
研究人员从埃及Helal仙人掌农场采集金琥样本，分离茎部内生真菌并鉴定为米曲霉。分别制备金琥茎和刺的80%甲醇提取物，以及真菌的乙酸乙酯（EtOAc）和甲醇（MeOH）提取物。通过体外实验评估所有提取物对AChE和BACE-1的抑制活性，并量化总酚、总黄酮和总生物碱含量。采用GC-MS分析刺提取物，UPLC-MS/MS对刺和真菌提取物进行代谢物谱分析，再通过分子对接和分子动力学（MD）模拟研究关键化合物的结合机制。

结论：金琥刺提取物和米曲霉乙酸乙酯提取物均表现出强效的AChE和BACE-1抑制活性，IC₅₀值在0.255–0.550 μg/mL范围内。代谢物鉴定揭示刺中含有27种化合物（包括生物碱、黄酮类、酚酸等），真菌提取物中含有14种化合物（包括聚酮、生物碱、萜类等）。分子对接和MD模拟证实，terrusnolide A、versicolactone B、isorhamnetin-3-O-rhamnoside和quercetin-3-gentiobioside等化合物与靶酶形成稳定相互作用。该研究首次系统比较了金琥刺及其内生真菌的神经保护潜力，表明两者可作为双靶点天然抑制剂来源，为AD治疗提供新候选分子。论文发表在《Scientific Reports》。

**关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1）植物材料来自埃及Helal仙人掌农场，经Prof. Abdo Marei Hamed鉴定；内生真菌从茎部无菌分离，由Dr. Amal A. E. Mekawy鉴定为米曲霉。2）总酚含量采用Folin-Ciocalteau法测定（以没食子酸当量表示），总黄酮含量采用AlCl₃比色法（以槲皮素当量表示），总生物碱含量采用溴甲酚绿比色法（以阿托品当量表示）。3）化学谱分析：刺提取物经GC-MS分析，刺和真菌提取物经UPLC-ESI-MS/MS非靶向代谢组学分析。4）体外酶抑制：使用商业化试剂盒（BioVision）测定AChE和BACE-1抑制活性。5）计算模拟：对所有鉴定化合物进行分子对接（PDB: 4M0E和4LXM），对得分最高化合物进行分子动力学（MD）模拟（100 ns）。

**研究结果**

**总酚、总黄酮和总生物碱含量**
通过Folin-Ciocalteau法、AlCl₃比色法和溴甲酚绿比色法测定，金琥刺提取物表现出最高的总酚含量（293.0 ± 3.2 mg GAE/g）、总黄酮含量（132.1 ± 1.3 mg QE/g）和总生物碱含量（14.46 ± 0.39 mg阿托品当量/g），显著高于茎提取物（145.9 ± 2.1 mg GAE/g）。这表明刺是次生代谢物的富集部位。

**GC-MS分析**
GC-MS分析在金琥刺提取物中鉴定出11种化合物，主要成分为甘油1-棕榈酸酯（19.96%）和2,3-二羟基丙基硬脂酸酯（15.33%），并检测到三种生物碱：3-oxo-20-methyl-11-α-hydroxy conanine-1,4-diene、3α-hydroxy-6-benzyl-6-azacholest-4-en-7-one和2-acetyl-3-(2-cinnamido)ethyl-7-methoxyindole。

**UPLC-ESI-MS/MS代谢物谱**
- **金琥刺提取物**：在正负离子模式下初步鉴定出27种代谢物，包括5种苯乙胺类生物碱（如hordenine、candicine、N-acetyl tyramine等）、16种黄酮类化合物（如apigenin、naringenin、kaempferol、quercetin及其糖苷）、3种酚酸（chlorogenic acid、ferulic acid β-glucoside、protocatechuic acid）以及sucrose、ferulaldehyde和stigmasterol。
- **米曲霉乙酸乙酯提取物**：初步鉴定出14种化合物，包括聚酮（aspergilsmin C）、环碳酸酯（aspergillusol B）、喹诺酮（viridicatin）、异喹啉生物碱（fumisoquin C、versiquinazoline F）、α-吡喃酮（campyrone C）、γ-丁烯内酯-呋喃酮二聚体（aspersclerotiorone A）、异吲哚（pyranterrone A）、酚类（aspergilol F）、丁烯内酯（terrusnolide A）、曲酸衍生物（dikojiacid A）、丁内酯（versicolactone B）和异戊烯基对三联苯（prenylterphenyllin F）等。

**体外AChE和BACE-1抑制活性**
所有提取物均呈剂量依赖性抑制两种酶。金琥刺提取物对AChE的IC₅₀为0.362 ± 0.012 μg/mL，对BACE-1为0.425 ± 0.014 μg/mL；米曲霉乙酸乙酯提取物对AChE的IC₅₀为0.255 ± 0.008 μg/mL，对BACE-1为0.550 ± 0.018 μg/mL，活性优于茎提取物及真菌甲醇提取物。

**分子对接研究**
分子对接显示，米曲霉乙酸乙酯提取物中的terrusnolide A（9）与AChE（PDB: 4M0E）结合评分最高（?10.9 kcal/mol），versicolactone B（11）与BACE-1（PDB: 4LXM）评分最高（?9.9 kcal/mol）；金琥刺提取物中的isorhamnetin-3-O-rhamnoside（18）和quercetin-3-gentiobioside（15）分别对AChE和BACE-1表现出高亲和力（?10.3至?10.8 kcal/mol和?9.6 kcal/mol）。这些化合物得分高于阳性对照donepezil（?9.5 kcal/mol）和curcumin（?7.9 kcal/mol）。相互作用分析表明，氢键、疏水接触和π-π堆积是主要作用力。

**分子动力学模拟**
对terrusnolide A（9）与AChE、versicolactone B（11）与BACE-1、isorhamnetin-3-O-rhamnoside（18）与AChE、quercetin-3-gentiobioside（15）与BACE-1进行100 ns MD模拟。RMSD显示酶骨架稳定（~1.5–2.5 ?），配体结合位点未扩散。RMSF表明配体相互作用残基的波动降低，形成稳定结合口袋。配体-蛋白接触分析显示，9和11主要依赖疏水作用和氢键，18和15则依赖水桥和氢键。半径回旋（rGyr）和溶剂可及表面积（SASA）稳定，表明配体始终埋藏在结合口袋内。

**总结与讨论**
讨论部分指出，金琥刺中高含量的酚类、黄酮和生物碱，尤其是hordenine、apigenin、quercetin、naringenin、kaempferol、isorhamnetin等，与已知的神经保护活性一致。这些化合物可通过抑制AChE和BACE-1、降低氧化应激和神经炎症等机制发挥作用。真菌代谢物如terrusnolide A、versicolactone B等首次被报道具有抗AD潜力，其结合模式与已知抑制剂相似。分子动力学模拟进一步验证了酶-配体复合物的稳定性。本研究不足之处在于缺乏细胞和体内验证，需后续研究确认安全性和有效性。

**结论**
本研究探索了金琥（刺和茎）及其相关内生真菌米曲霉的神经保护潜力。两种来源的提取物均表现出对AChE和BACE-1（阿尔茨海默病的关键酶）的强效抑制活性。化学分析表明这些提取物富含酚类、黄酮和生物碱。利用GC和UPLC-MS/MS进行的详细谱分析鉴定出多种生物活性代谢物，其中若干在分子对接研究中表现出对AChE和BACE-1的高结合亲和力。分子动力学模拟进一步验证了这些相互作用的稳定性。总体而言，研究结果表明金琥及其内生真菌米曲霉代表了用于阿尔茨海默病的多靶点天然抑制剂的有前景来源。实验酶抑制测定、计算分析以及若干已鉴定代谢物先前报道的神经保护活性支持了所提出的双靶点神经保护潜力。然而，仍需进一步的细胞和体内研究以建立这些生物活性化合物的全面生物学验证和安全性特征。