番荔枝紫玉盘籽的主要毒性成分：毒性导向分离、发育与神经毒性及代谢干扰

《International Journal of Molecular Sciences》：Squamocin as the Principal Toxic Constituent of Annona squamosa Seeds: Toxicity-Guided Isolation, Developmental and Neurotoxicity, and Metabolic Perturbations

　　

番荔枝紫玉盘籽的传统医学和食品领域应用广泛，然而其安全性特征尚不明确，且主要毒性成分未知。本研究旨在鉴定其主要毒性成分并阐明其毒理学机制。研究人员采用斑马鱼幼鱼作为毒性导向分离策略的模型，结合形态学、行为学、生物化学、代谢组学 和转录组学分析。生物测定导向的分馏技术鉴定出squamocin（一种番荔枝内酯）为主要毒性成分，这是首次报道从番荔枝紫玉盘中分离出的急性毒性物质。squamocin在纳摩尔浓度下即表现出强效的多器官毒性 (LC₁₀ = 62 nM; LC₅₀ = 75 nM)，包括致死性、发育致畸性和颅面软骨发育不良，且未伴随严重的生长迟缓。神经毒性呈剂量依赖性：20 nM时表现为运动抑制，40 nM时表现为运动不协调。代谢组学分析揭示了氨基酸和聚糖代谢受到干扰，转录分析证实了应激相关基因 (pipox, myd88, 和 rigi) 的表达发生改变。这些研究结果确立了squamocin为番荔枝紫玉盘籽的主要毒性成分，并为其广泛的毒理学表现提供了机制框架，为该材料的安全使用提供了科学指导。

番荔枝紫玉盘籽作为热带果树，其果肉富含营养物质而被广泛食用，但在加工过程中通常被废弃的种子却富集了大量具有药理活性的次级代谢产物，尤其是番荔枝内酯。尽管这些成分展现出良好的抗肿瘤等药理潜力，但其伴随的毒副作用引发了对其安全性的担忧。目前的研究大多聚焦于annonacin等单一已知ACGs，或停留在粗提物层面，且对毒性机制的理解局限于线粒体复合体I抑制和tau/α-突触核蛋白病，尚缺乏在单一化合物层面对其他毒性成分及更广泛的毒理学终点（如代谢干扰、炎症）的系统探索。为了突破现有的认知局限并全面评估其安全性，研究人员开展了一项旨在追踪并鉴定其主要毒性成分的研究。该研究成功明确了squamocin的毒性地位，并揭示了其多系统毒性特征与机制，该成果发表在《International Journal of Molecular Sciences》。在关键技术方法上，研究人员基于斑马鱼幼鱼模型采用毒性导向分离策略，依次运用硅胶柱色谱与制备型高效液相色谱 对采自中国广西的干燥种子进行逐步分离与提纯，并通过核磁共振(NMR)与高分辨质谱(HR-MS)进行结构鉴定；在毒性评估方面，整体研究整合了形态学显微观察、运动行为轨迹分析、荧光组织染色、生化酶活性测定等多项技术；此外，结合靶向与非靶向技术，研究人员运用了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)基础上的非靶向代谢组学分析，以及基于定量实时PCR(RT-qPCR)的转录水平验证以深入解析其机制。

毒性导向分离与结构鉴定：通过对干燥种子进行递进式溶剂萃取、柱色谱及HPLC分离，并利用斑马鱼幼鱼在各步骤进行毒性监测，研究人员最终从具有100%致死活性的乙酸乙酯组分中分离出单一毒性成分。结构鉴定及定量分析证实该化合物为squamocin（一种ACG），占新鲜种子含量的0.012%。

squamocin诱导的发育毒性：通过将斑马鱼幼鱼暴露于一系列浓度的squamocin并连续监测生存、孵化、形态及体长指标，研究人员发现该化合物具有极强毒性，其LC₁₀与LC₅₀分别为62 nM和75 nM。在亚致死浓度下，该毒性物质诱发了明显的脊柱弯曲、心包水肿及卵黄囊吸收延迟等畸形特征，且畸形率随剂量上升而显著增加，但并未引发显著的体长缩短现象。

squamocin诱导的软骨发育改变：为探究颅面形态发生是否受损，研究人员在染毒后对斑马鱼幼鱼进行了阿尔新蓝染色并测量关键软骨参数。结果显示，暴露于squamocin的幼鱼出现了明显的颅面结构异常，表现为Meckel氏软骨与舌角软骨间的间距显著缩短、舌软骨长度显著减小，且舌软骨夹角在40 nM暴露组中明显增大。这些缺陷共同导致了颅底结构崩塌及面部不对称。

squamocin诱导的神经功能改变：在神经毒性评估方面，通过对幼鱼的运动轨迹追踪发现，20 nM暴露组的总游泳距离显著减少且平均游速降低，表现为运动抑制；但40 nM暴露组总距离反而大幅增加。进一步的检测表明，20 nM和40 nM组脑部神经元凋亡率均呈剂量依赖性显著上升。此外，生化定量检测证实，squamocin在低至10 nM时即可显著抑制乙酰胆碱酯酶 活性，并导致活性氧(ROS)水平在幼鱼体内呈剂量依赖性显著蓄积，破坏了运动协调能力并触发氧化应激。

squamocin暴露引起的代谢干扰：通过基于液质联用的非靶向代谢组学分析，研究人员观察到暴露组与对照组之间存在显著的代谢谱分离，共筛选出27种伴随浓度上升而改变的内源性代谢物。代谢通路富集及RT-qPCR验证表明，这些差异代谢物主要集中在赖氨酸降解、聚糖降解以及C型凝集素受体信号通路等途径，且参与应激反应的基因(pipox, myd88, rigi)表达量显著升高，提示毒性发生伴随着氨基酸代谢失衡与免疫应答干扰。

在讨论部分，研究人员重点指出该分离策略的首创性，并进一步阐释了毒性表型背后的深层机制。squamocin在极低的纳摩尔浓度下即可诱发多器官毒性，其导致发育畸形的过程并未伴随躯体的过度生长迟缓，说明其选择性靶向器官发生而非一般的躯体生长。同时，运动表型在不同剂量下发生转换：低剂量下的运动抑制源于胆碱能神经传递受抑与轻度氧化应激；而高剂量下由于严重的躯体畸形、广泛的神经元凋亡和NRF₂等神经炎症相关基因的高表达，导致严重的运动协调丧失，表现为痉挛与无序挣扎，从而掩盖了原有的运动距离缩减。在代谢与转录异常方面，研究讨论了氨基酸代谢紊乱对胚胎发育及运动协调的广泛影响，并指出C型凝集素受体及RIG-I样受体轴的异常激活会导致神经炎症发生。综上所述，研究得出明确结论：通过基于斑马鱼的毒性导向分离，squamocin被确认为首次报道的番荔枝紫玉盘籽急性主要毒性成分，其表现出涵盖致死性、致畸性、颅面软骨发育不良、神经毒性及代谢紊乱在内的广泛毒性谱，其神经毒性源于AChE抑制与ROS蓄积的双重机制，代谢毒性涉及氨基酸与聚糖代谢紊乱并伴随应激相关信号通路异常。这些发现为评估该材料的临床安全规范提供了重要指导。