单管反转录环介导等温扩增（Reverse Transcription–Loop-Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）检测法用于鱼类红点石斑鱼神经坏死病毒（Red-Spotted Grouper Nervous Necrosis Virus, RGNNV）的快速检测

《Viruses》：Single-Tube Reverse Transcription–Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Red-Spotted Grouper Nervous Necrosis Virus in Fish Species

　　

乙型诺达病毒（Betanodavirus）是病毒性神经坏死病（Viral Nervous Necrosis, VNN）的病原，是全球海洋及咸淡水水产养殖的主要威胁。该病毒引发流行爆发，在仔鱼和稚鱼阶段发病率与死亡率极高，造成水产养殖重大经济损失。研究人员开发了一种快速高灵敏的单管反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测法，用于检测鱼类组织样本中红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）基因型的感染。研究人员针对RGNNV的RNA2衣壳蛋白基因的8个保守区域设计了6条引物，这些区域在RGNNV基因型间具有保守性。RT-LAMP检测在65 °C的单管体系中结合反转录与等温扩增于60分钟内完成，结果通过加入SYBR Green I染料直接可视化，产生从橙色（阴性）到绿色（阳性）的颜色变化，肉眼或在紫外光照射下均可观察。所开发的RT-LAMP检测能从感染样本中检测到5拷贝的RGNNV，灵敏度比常规反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription-PCR, RT-PCR）高20倍。该检测在两种鱼类宿主（亚洲海鲈和军曹鱼）中表现出诊断敏感性和特异性，且不与罗非湖病毒（tilapia lake virus）和鲤疱疹病毒2型（cyprinid herpesvirus-2）等其他鱼类病毒发生交叉反应。所开发的检测方法简便、经济、特异，可实现鱼组织中RGNNV的快速检测。这种单管RT-LAMP检测可应用于亲鱼设施、鱼苗、养殖场、检疫设施以及池塘或网箱放养前稚鱼的筛查，有助于预防水产养殖系统中疾病爆发及RGNNV的传播。

该研究围绕水产养殖中由乙型诺达病毒（Betanodavirus）引起的病毒性神经坏死病（Viral Nervous Necrosis, VNN）展开。VNN影响超过120种海洋鱼类及部分淡水鱼类，在仔鱼和稚鱼阶段造成大规模死亡与严重经济损失，且存活个体可作为带毒者进行水平与垂直传播。目前常规诊断方法如组织病理学、免疫染色和细胞培养耗时费力且需装备精良的实验室；分子方法如反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription-PCR, RT-PCR）虽提高了敏感性但需昂贵仪器与专业人员，难以现场检测。此外，既往报道的RT-LAMP检测多基于地理受限分离株或单一基因型及有限宿主验证，部分还需专用浊度监测仪。为此，研究人员开展了针对红点石斑鱼神经坏死病毒（Red-Spotted Grouper Nervous Necrosis Virus, RGNNV）基因型、整合反转录与扩增于单管、基于SYBR Green I可视化的RT-LAMP检测开发研究，旨在提供一种快速、灵敏、特异且低成本适用于资源有限环境的诊断工具。该研究发表于《Viruses》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：从印度卡纳塔克邦和喀拉拉邦等地海笼养殖场收集自然感染的亚洲海鲈（Lates calcarifer）及军曹鱼（Rachycentron canadum）临床样本队列，经组织学及RT-PCR确认；基于RGNNV RNA2衣壳蛋白基因（GenBank MG202137.1）保守区使用在线软件设计6条特异性引物（F3、B3、FIP、BIP、LF、LB）并进行序列比对评估；优化单管RT-LAMP反应温度、MgSO₄浓度、dNTPs、引物浓度及时间等参数；通过体外转录获得RNA2基因作为阳性对照并建立10倍系列稀释测定检测限（Limit of Detection, LOD）；使用临床确诊阳性与阴性样本及罗非湖病毒、鲤疱疹病毒2型样本评估诊断敏感性和特异性与交叉反应性；采用Clopper–Pearson法计算95%置信区间进行统计分析。

3.1. Optimisation of Reaction

研究人员通过依次优化反应温度、MgSO₄浓度、dNTPs浓度及各引物浓度与时间，确定最佳条件为65 °C、60分钟、4 mM MgSO₄、1.4 mM dNTPs（各）、内引物1.6 μM、外引物0.3 μM、环引物0.4 μM。在此条件下阳性对照显示最强特异性荧光，阴性对照无信号。加入1:100稀释SYBR Green I后，阳性反应呈亮绿色，阴性及无模板对照保持橙色，肉眼及365 nm紫外光下均可清晰分辨，琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带。

3.2. Sensitivity of the Assay

研究人员使用体外转录的RGNNV RNA2进行10倍系列稀释（5、50、500、5000拷贝/反应）测试，结果显示所开发RT-LAMP检测的一致检测下限为5拷贝/反应，而同期平行测试的常规RT-PCR检测下限为100拷贝/反应，表明该RT-LAMP分析灵敏度比常规RT-PCR高20倍。

3.3. Evaluation and Specificity of the Assay

研究人员使用30份亚洲海鲈和30份军曹鱼的RT-PCR确诊RGNNV阳性组织及相应各30份未感染阴性对照进行评估。RT-LAMP正确识别所有阳性样本（临床敏感性100%）及所有阴性样本（临床特异性100%），95%置信区间为88.4–100%。该检测与罗非湖病毒RNA及鲤疱疹病毒2型DNA无交叉反应，未感染对照及无模板对照均为阴性。

讨论部分指出，环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）作为鱼类病原快速高敏诊断工具备受关注，既往虽有针对RGNNV的RT-LAMP报道，但多限于单一宿主或需专用仪器。本研究靶向RGNNV RNA2衣壳蛋白基因T4可变域高保守区设计六引物靶向八区域，提升扩增效率，分析检测限达5拷贝/反应，且在亚洲海鲈与军曹鱼临床样本中验证适用多物种，仅需简易加热设备与目视判读，降低成本与时间，适于孵化场及现场筛查。研究人员也指出局限：仅针对RGNNV基因型，未评估对其他基因型（SJNNV、TPNNV、BFNNV）的检测能力，仅在实验室纯化RNA及临床样本验证，未评估实地条件影响因素及试剂长期稳定性，未来需扩大样本、物种、病毒谱及地理分离株验证。

结论部分译为：研究人员开发了一种用于鱼组织样本中RGNNV快速、经济、特异检测的单管RT-LAMP检测法。其与简易加热设备及目视读出的兼容性使其适用于资源有限的水产养殖诊断实验室、养殖场、移动诊断单元、亲鱼设施、检疫设施及放养前鱼苗稚鱼筛查。该检测有助于水产养殖业及时检测RGNNV，制定适宜策略以控制疾病发生与传播。

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