综述：同位素稀释质谱方法在认证参考物质中目标蛋白定量中的开发与应用

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：The development and use of isotope dilution mass spectrometry methods for the quantification of target proteins in certified reference materials

　　

同位素稀释质谱（IDMS）最初于20世纪70年代末和80年代初为小分子开发，现在也成为那些希望表征基于基质的认证参考物质（CRMs）中蛋白质质量分数或物质含量的人的首选定量方法。虽然仪器因素会影响IDMS方法的准确性，但双IDMS、高阶方法和“精确匹配”的使用已大大提高了结果的准确性。本综述展示了IDMS用于蛋白质定量的发展历程，从最初仅使用同位素标记肽作为内标对初级校准物进行赋值的方法，发展到使用同位素标记重组完整蛋白作为内标对血清和血液等复杂生物基质中蛋白质进行定量的方法。研究人员将讨论当前使用的有机IDMS肽基方法在测量物定义、样品与内标平衡、酶解效率以及内标稳定性和适用性方面的挑战和局限性。本文回顾了用于表征CRMs的肽基和蛋白基IDMS方法准确性评估所采取的步骤，以及确保实验室诊断中可追溯至患者水平的可比性要求。此外，它还展望了未来的挑战，例如在结果中纳入结构和蛋白质活性信息。

论文主体部分首先在引言中回顾了同位素稀释（ID）的历史基础，从1935年Rittenberg和Schoenheimer开创性使用稳定同位素示踪氨基酸和脂质代谢，到同位素稀释质谱（IDMS）在无机分析中的成熟，热电离质谱（TIMS）、火花源质谱（SSMS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等高精度同位素比测量技术推动了IDMS成为元素分析的权威方法。在有机分析中，氘和¹³C标记内标在药代动力学中至关重要，美国国家标准与技术研究院（NIST）率先使用IDMS认证临床认证参考物质（CRMs）中的小分子分析物，如葡萄糖、胆固醇和肌酐。1993年，化学测量纳入米制公约的物质量咨询委员会（CCQM）活动，推动了计量学在临床和环境化学中的应用，IDMS被确认为潜在的主要比值方法。在蛋白质分析方面，早期使用快速原子轰击质谱（FAB-MS）和电喷雾电离（ESI）实现了肽和蛋白质的可电离化，1996年Barr等人引入特征肽方法，使用稳定同位素标记肽作为内标定量血清中的载脂蛋白A-I，成为蛋白质IDMS最广泛使用的方法。然而，完整蛋白质的IDMS面临挑战，如同位素分布分散信号、低浓度样品的信噪比需求，以及蛋白质结构信息的缺失。

在“基质RM表征和赋值的IDMS挑战”部分，论文详细阐述了IDMS的基本原理：将已知同位素组成的样品与同位素标记的“加标物”混合，形成样品-加标混合物（bx），其同位素比反映样品中分析物浓度。关键挑战是样品与加标的完全平衡，尤其在生物基质中，加标需与内源分析物行为一致，包括与结合蛋白的相互作用。双IDMS方法通过使用校准器（如纯物质或基质CRM）计算样品中分析物浓度，公式为w_x = w_z · (m_yx/m_x) · (m_z/m_yz) · ((R_y - R_bx)/(R_bx - R_x)) · ((R_bz - R_z)/(R_y - R_bz))，其中精确匹配方法可避免空白校正。高阶IDMS如三IDMS无需表征加标，但需复杂样品制备。

在“初级校准物评估”部分，论文介绍了三种主要方法。基于元素的液相色谱-电感耦合等离子体-IDMS（LC-ICP-IDMS）用于肽和蛋白质纯度评估，利用硫等杂原子进行绝对定量，通过³⁴S标记蛋氨酸等加标物，适用于金属蛋白的定量，但硫灵敏度低、背景高。基于氨基酸分析的LC-IDMS（AAA-IDMS）通过强酸水解将蛋白质转化为游离氨基酸，再用稳定同位素标记氨基酸加标定量，适用于纯蛋白质校准物，但需注意氨基酸消旋化和脯氨酸异构化，且仅适用于无其他氨基酸来源的纯材料，否则需通过肽杂质校正氨基酸分析（PICAA）进行校正。基于特征肽的LC-IDMS用于肽和蛋白质纯度评估，工作流程包括选择特征肽（需高蛋白酶特异性、稳定的LC-MS行为、无漏切或不稳定位点）、合成重同位素标记肽内标，并使用双IDMS方法，其中肽校准物需通过qNMR或AAA验证纯度。酶解完全性至关重要，加标时机影响准确性，可通过延长酶解、高酶底物比、联合蛋白酶等优化。

在“超越LC-IDMS的其他同位素稀释策略”部分，论文提到了在线碳IDMS（将肽燃烧为CO₂测量¹³C/¹²C比）和GC-IDMS（衍生化后经气相色谱分离并通过AAA-IDMS定量），以及同位素稀释拉曼光谱和GC-ID红外光谱等正交方法。

在“IDMS在肽和蛋白质纯度评估中的应用”部分，论文指出主要应用是生产CRMs，许多国家计量院（NMIs）已为临床重要蛋白质建立IDMS参考测量程序（RMPs），如C肽、胰岛素、前列腺特异性抗原、牛乳铁蛋白、重组人生长激素、甲状旁腺激素（PTH）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、热休克蛋白90α（HSP90α）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和降钙素原等。COVID-19疫情期间，也快速开发了SARS-CoV-2相关蛋白及单克隆抗体的IDMS定量方法。

在“参考物质应用及与常规测量（如免疫测定）的关系”部分，论文讨论了蛋白质IDMS的主要挑战。测量物定义因蛋白质的结构异质性（如翻译后修饰PTMs、二硫键乱序）而困难，IDMS的高选择性可能成为挑战，因为免疫测定通常检测一组异构体，而IDMS针对特定肽段，可能导致测量物定义不一致，影响标准化。肽基校准存在肽段不完全释放的缺点，因此尽可能使用完整蛋白作为校准物和内标。蛋白质稳定性（如脑钠肽BNP）也是挑战。临床需求方面，实验室医学要求结果可追溯，国际临床化学和实验室医学联合会（IFCC）和国际实验室认可合作组织（ILAC）等成立了实验室医学可追溯性联合委员会（JCTLM），建立可追溯性框架，IDMS被认为是金标准方法。生物制药方面，生物制药标准化需确保复杂生物药物的安全性和有效性，涉及多种分析平台，IDMS在建立SI可追溯性中发挥作用，但行业与NMIs合作有限，WHO已引入一些标准物质如英利昔单抗、利妥昔单抗等。食品和食品产品方面，CRMs用于评估麸质和食品过敏原蛋白，但麸质的定义复杂，ELISA是主要技术，IDMS用于肽基方法时需考虑蛋白提取和转换因子，例如通过定量11种肽段（代表95%以上牛奶蛋白组）来评估总过敏原食品蛋白，并应用于饼干基质CRM和欧盟能力验证计划。

在“展望：未来挑战”部分，论文强调CRMs是可追溯性链的关键，但不同测量原理（如IDMS与免疫测定）之间的差异仍存在，可能源于蛋白结构变异、PTMs或聚集。未来需要多学科方法，结合结构分析技术（如X射线晶体学、核磁共振NMR、离子迁移质谱IM-MS、氢氘交换质谱HDX-MS、化学交联质谱XL-MS）来表征蛋白质整体结构，并建立结构与功能的关系。欧洲项目EURAMET 23FUN06 ProMET旨在研究蛋白质结构对测量结果和功能的影响，并建立计量框架。此外，未来挑战还包括在复杂系统（如病毒载体）中表征蛋白质CRMs，以及将IDMS可追溯性扩展到大规模蛋白质组学，实现绝对定量，从而推动蛋白质组学向临床诊断、动物健康、食品评估等领域的常规应用。国际计量界已通过CCQM研讨会认识到这一需求，并计划将蛋白质组学标准化纳入2030+战略。