准灌注方法用于悬浮稳定生产细胞系的放大和优化，以在高细胞密度下连续生产慢病毒载体

《Biochemical Engineering Journal》：Quasi-perfusion method for scaling and optimisation of a suspension stable producer cell line for continuous manufacturing of lentiviral vectors at high cell density

　　

一种稳定产生慢病毒载体（LV）的贴壁HEK细胞系被适应到悬浮培养以实现高细胞密度培养。弗劳德数（Froude number, Fr）被成功用作微量滴定板（MWP）和摇瓶之间的新型放大参数。使用在准灌注模式下操作的缩小MWP方法优化了培养基。

**论文解读：悬浮稳定生产细胞系的准灌注放大与优化——迈向慢病毒载体连续生产的高细胞密度策略**

**研究背景与问题**
细胞与基因治疗是癌症治疗的前沿方向，其中慢病毒载体（LV）因其高效转导多种细胞的能力（如将T细胞修饰为CAR-T细胞）而成为关键工具。然而，自体CAR-T疗法的单次费用高达180万美元，主要成本驱动因素之一便是LV的生产。传统LV生产依赖贴壁培养（如T-flask、微载体）或瞬时转染，存在空间效率低、操作成本高、不适用于长期连续培养等局限。为降低成本并提高产量，工业界正转向集成连续生物制造（ICB），其中上游灌注（perfusion）生物反应器可维持高细胞密度（HCD），并缩短LV在反应器中的停留时间（因LV半衰期在37℃仅16.6小时）。此外，悬浮稳定生产细胞系（S-SPCL）相比贴壁培养能更高效利用空间，且化学成分限定（CD）培养基比含血清培养基更可控、可放大。然而，目前缺乏在高通量小规模平台（如微量滴定板，MWP）中进行准灌注优化的方法，也缺少从摇瓶到MWP的可靠缩放参数。因此，本研究旨在：①将贴壁LV稳定生产细胞系WRH1（使用非细胞毒性包膜蛋白RDpro）适应为悬浮细胞系WRH1-S；②引入弗劳德数（Fr）作为摇瓶与MWP间的缩放参数；③利用MWP准灌注模式高通量优化培养基，实现高细胞密度培养。

**主要技术方法**
研究人员采用全合一适应法（all-in-one adaptation），将贴壁WRH1细胞直接接种于9种CD培养基中，在125 mL摇瓶（180 RPM）中逐步适应，筛选出Freestyle 293和CDM4两种成功培养基。缩放参数基于弗劳德数（Fr = πn(d+do)/√(gd)，其中n为转速，d为容器直径，do为轨道直径）计算，确定24孔MWP（195 RPM）与125 mL摇瓶（180 RPM）的Fr值相等（1.06）。准灌注培养采用每日100%培养基更换（1 VVD），通过牺牲井法（sacrificial well methodology）每日取样，使用Vi-CELL计数细胞密度，CuBiAn分析代谢物，流式细胞术检测GFP标记的LV感染性滴度。细胞系来源：WRH1来自Sanber等（2019），HEK-293-ST来自Howe等（2021）。

**研究结果**

**3.1 悬浮适应（WRH1至WRH1-S）**
通过9种培养基测试，4种成功（HEK TF、Freestyle 293、CTS LV-MAX、BalanCD HEK293、CDM4），其中Freestyle 293最快（33天达90%以上活力）。Freestyle 293和CDM4被选为后续培养基。适应后细胞仍稳定产生LV（GFP表达验证）。第二次适应（扩增4周）和第三次适应（扩增2周）均成功，但发现长期培养（>3个月）导致LV产量下降，提示需缩短种子链或使用预适应细胞系。

**3.2 基于Fr的缩放参数**
Fr计算表明，125 mL摇瓶在180 RPM时Fr=1.06，对应24孔MWP在195 RPM时Fr=1.06，两者几何相似，可实现相同的混合与传质条件。

**3.3 Fr缩放参数的实验验证**
在准灌注模式下（1 VVD），MWP（195 RPM）与摇瓶（180 RPM）培养8天，细胞密度峰值分别达37和34 MVC mL^-1，高于文献报道的S-SPCL灌注培养值。代谢物（氨、葡萄糖、乳酸）浓度及细胞比生产率（CSP）在两平台间可比。功能性LV的容积生产率（VP）在第5天最高（MWP: 9.8×10⁵ TU mL^-1 day^-1；摇瓶: 6.0×10⁵ TU mL^-1 day^-1），无统计显著差异（p=0.163），证明Fr有效缩放。

**3.4 195 RPM MWP与180/195 RPM摇瓶比较（第三次适应）**
第三次适应后，MWP（195 RPM）与摇瓶（180 RPM）的细胞密度峰值（32.6 vs 32.8 MVC mL^-1）可比，但MWP提前2天达到。摇瓶在195 RPM时峰值达41.8 MVC mL^-1，高于180 RPM，提示更高转速增强氧传质。代谢物和CSP在MWP与180 RPM摇瓶间可比，但195 RPM摇瓶的乳酸CSP在后期显著降低，可能与高细胞密度下乳酸共消耗有关。MWP的累积转导单位（CTU）与180 RPM摇瓶可比，验证了缩放有效性。相比第一次适应（3个月），第三次适应（2周）的CSP提高7倍，但CSP仍低于文献（0.073 vs 20.4 TU cell^-1 day^-1）；然而，VP相比贴壁WRH1提高4.6倍，表明悬浮HCD培养的优势。

**3.5 MWP准灌注方法实现HEK高细胞密度**
使用非生产细胞系HEK-293-ST在CDM4+10% CB5培养基中，以不同接种密度（1-23 MVC mL^-1）进行准灌注培养，最高细胞密度达53.1 MVC mL^-1（接种9 MVC mL^-1），为文献中HEK准灌注培养的最高值之一。该结果证明MWP方法可有效优化HEK灌注培养基，并为未来LV生产提供HCD平台。

**讨论与结论**
本研究成功将贴壁WRH1适应为悬浮WRH1-S，并首次在24孔MWP中实现HEK准灌注优化，利用Fr参数实现从摇瓶到MWP的可预测缩放。尽管CSP相比贴壁培养下降40%，但VP提高4.6倍，证明悬浮HCD策略的成本效益。MWP平台因体积小（1.2 mL）、可自动化、高通量，适用于培养基和细胞系筛选，为大规模灌注工艺优化提供快速经济模型。主要挑战包括：氧传质与剪切力平衡（HEK比CHO更敏感）、细胞保留装置（如中空纤维）的剪切影响、以及细胞系长期稳定性。结论：通过全合一适应方法获得悬浮稳定生产细胞系，Fr成功作为缩放参数，MWP准灌注方法可行，实现了高细胞密度（53.1 MVC mL^-1）和LV产量提升，为LV连续生产奠定了基础。