胶质母细胞瘤细胞中GOLPH3的减少通过影响mTOR信号通路，促进抗肿瘤效应和神经元分化。

《European Journal of Cell Biology》：GOLPH3 depletion in glioblastoma cells promotes anti-tumor effects and neuronal differentiation by affecting mTOR signaling

　　

胶质母细胞瘤是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤。胶质母细胞瘤对标准化疗药物替莫唑胺（TMZ）的耐药性与DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）的表达相关。此外，肿瘤的起始和复发与一类具有自我更新能力、多能性以及对化疗和放疗均耐药的胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）亚群有关。为了鉴定新的分子生物标志物和治疗靶点，研究人员探讨了癌蛋白高尔基磷酸化蛋白3（GOLPH3）在胶质母细胞瘤中的可能作用。GOLPH3在多种实体瘤中过表达，并能赋予对DNA损伤化疗药物的耐药性。其过表达还与包括胶质母细胞瘤在内的多种癌症的不良预后相关。在此，研究人员显示，在U87MG胶质母细胞瘤细胞中敲低GOLPH3可抑制细胞增殖、促进衰老，并诱导朝向神经元样表型的显著细胞和分子变化。研究人员分析了U87MG细胞以及三种分别代表胶质母细胞瘤三种分子亚型的GSCs中GOLPH3、MGMT和雷帕霉素机械靶标（mTOR）信号蛋白的组成性表达。结果表明，这些胶质母细胞瘤细胞模型可能对mTOR抑制和TMZ表现出不同的反应。最后，研究人员发现，GOLPH3缺失可降低mTOR复合物1和2的活性，导致U87MG细胞和BT379 GSCs亚型中其各自下游靶标S6K和Akt的磷酸化水平下降。该发现揭示了一种潜在的治疗脆弱性，可用于开发针对胶质母细胞瘤患者的个性化治疗方案。

论文解读文章

**研究背景与问题**

胶质母细胞瘤（IDH野生型，WHO 2021分类）是成人最致命的恶性原发性脑肿瘤，中位生存期仅12-15个月。根据2017年Wang等提出的深度分子分型，胶质母细胞瘤可分为经典（CL）、前神经元（PN）和间充质（MES）三种亚型，各具有独特的基因组改变和转录程序。肿瘤的恶性进展和治疗耐药性主要归因于胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）的存在，这些细胞具有自我更新、多能性和治疗抵抗特性。目前标准治疗方案包括手术切除、放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗，但TMZ的疗效受限于DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）的表达，导致内在或获得性耐药。因此，阐明胶质母细胞瘤发展的信号通路并寻找新的分子标志物和靶向治疗策略至关重要。高尔基磷酸化蛋白3（GOLPH3）被鉴定为首个高尔基体癌蛋白，在多种实体瘤中过表达，与不良预后相关，并能通过激活雷帕霉素机械靶标（mTOR）信号促进肿瘤发生。然而，GOLPH3在胶质母细胞瘤中是否通过mTOR信号影响恶性表型（如增殖、分化等）仍不清楚。本研究旨在探讨GOLPH3缺失对胶质母细胞瘤细胞的影响，并评估其作为治疗靶点的潜力。

**研究内容与结论**

研究人员利用U87MG胶质母细胞瘤细胞系和三种患者来源的GSCs（分别代表CL、PN和MES亚型：BT379、BT273、BT168），通过小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术敲低GOLPH3，系统分析了其对细胞增殖、衰老、分化以及mTOR信号通路的影响。研究得出以下结论：GOLPH3缺失抑制U87MG细胞增殖，诱导细胞衰老和神经元分化；GOLPH3在U87MG和三种GSCs中均有表达，但不同亚型GSCs的mTOR信号组成性激活状态存在差异，仅MES亚型BT168细胞表达MGMT；GOLPH3缺失可同时抑制mTOR复合物1和2（mTORC1和mTORC2）的活性，降低下游效应分子S6K和Akt的磷酸化水平，这一效应在U87MG细胞和BT379 GSCs中均得到验证。该研究揭示了GOLPH3作为胶质母细胞瘤潜在治疗靶点的重要性，并提示基于mTOR信号活性的分子分型可能有助于开发个性化治疗方案。

**论文发表信息**：该论文发表在《European Journal of Cell Biology》。

**关键技术方法**

本研究主要采用以下关键技术方法：1）siRNA转染技术：使用特异性siRNA敲低U87MG细胞和BT379 GSCs中GOLPH3的表达，并以通用阴性对照siRNA（mock）作为对照；2）Western blot（WB）分析：检测细胞裂解液中GOLPH3、mTOR信号通路组分（如mTOR、Raptor、Rictor、S6K、Akt及其磷酸化形式）、MGMT、衰老标志物（Lamin B1、p27^Kip1）和神经元分化标志物（β III tubulin、Nestin）的蛋白水平；3）免疫荧光（IF）分析：结合DAPI染色，观察α-tubulin、Ki67等蛋白的细胞定位和表达；4）细胞增殖与死亡分析：通过Trypan blue染色计数进行细胞增殖时间曲线和死亡率的定量检测。样本来源：患者来源的GSCs（BT379、BT273、BT168）由意大利Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta惠赠，并依据Wang等（2017）分类法分为CL、PN和MES亚型。

**研究结果**

**3.1 GOLPH3在U87MG细胞中的缺失导致形态学变化**：通过WB确认siRNA有效敲低GOLPH3蛋白后，相衬显微镜和α-tubulin免疫荧光染色显示，GOLPH3缺失的U87MG细胞出现胞体增大和长突起形成等显著形态改变。

**3.2 GOLPH3下调在U87MG细胞中驱动衰老并促进神经元分化**：细胞增殖时间曲线显示GOLPH3敲低后细胞数量增长缓慢，但Trypan blue染色和cleaved caspase-3检测排除坏死和凋亡。Ki67免疫荧光显示GOLPH3缺失细胞中Ki67阴性细胞比例增加，提示细胞进入静止状态。WB分析发现衰老标志物Lamin B1表达下降、p27^Kip1表达上升，同时神经元特异性标志物β III tubulin逐渐增加，而干细胞标志物Nestin降低，表明GOLPH3缺失诱导U87MG细胞发生衰老和神经元分化。

**3.3 胶质母细胞瘤细胞中GOLPH3、mTOR信号组分和MGMT的组成性表达**：WB分析显示，U87MG细胞和三种GSCs（BT379、BT273、BT168）均表达mTOR激酶及其磷酸化形式（p-mTOR^Ser2448和p-mTOR^Ser2481），以及mTORC1组分（Raptor、TCTP、Rheb）和底物S6K（含p-S6K^Thr389），以及mTORC2组分（Rictor、SIN1、mLST8）和底物Akt。但BT273和BT168 GSCs中p-Akt^Ser473水平极低或不可检测，与此前报道的PTEN表达一致。MGMT仅BT168细胞表达，提示其可能对TMZ耐药。GOLPH3在所有细胞中均有表达。

**3.4 GOLPH3缺失削弱U87MG细胞和GSCs中的mTOR活性**：在U87MG细胞中，GOLPH3敲低显著降低p-S6K^Thr389、p-Akt^Ser473、p-mTOR^Ser2448和Raptor蛋白水平，同时增加p-NDRG1^Thr346和NDRG1表达。使用siRNA抗性GOLPH3构建体进行共转染可恢复上述mTOR信号相关蛋白变化，并逆转β III tubulin和p27^Kip1的改变，证实了GOLPH3的特异性。在BT379 GSCs中，GOLPH3敲低同样显著降低GOLPH3、p-S6K^Thr389、p-Akt^Ser473、p-mTOR^Ser2448和Raptor蛋白水平，表明mTOR信号受损。

**讨论与结论**

讨论部分指出，GOLPH3缺失引起的抗增殖、衰老和神经元分化效应与mTOR抑制相关，且与先前使用mTOR抑制剂雷帕霉素处理U87MG细胞的结果一致。不同GSCs亚型中mTOR信号组分（尤其是p-Akt^Ser473）的差异表达，提示这些细胞对mTOR抑制剂的敏感性可能不同，这对临床选择mTOR抑制剂（如替西罗莫司）的合适患者群体具有指导意义。此外，仅MES亚型GSCs表达MGMT，与TMZ耐药性相关，而GOLPH3缺失可能增强TMZ在耐药细胞中的疗效。研究结论：这些发现表明，胶质母细胞瘤细胞，特别是亚型特异性GSC群体，可能对mTOR抑制表现出不同的敏感性，突出了靶向该通路以开发患者定制治疗策略的相关性。由于GOLPH3已被报道赋予对DNA损伤化合物的耐药性，其失活可能作为一种策略，显著增强TMZ在耐药细胞类型中的疗效。