《International Journal of Biological Macromolecules》：Rapid screening and mechanism analysis of α-amylase inhibitors in apple polyphenols based on immobilized enzyme and HPLC-Q-TOF-MS/MS
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•构建了壳聚糖微球固定化的α-淀粉酶系统。•确定苹果多酚中的原花青素B2是具有α-淀粉酶抑制作用的核心成分。•通过多种技术结合，阐明了原花青素B2的抑制机制。引言糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，其特点是由于胰腺功能异常或胰岛素抵抗导致高血糖，进而引起葡萄糖积累并损害多个器官[1]、
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构建了壳聚糖微球固定化的α-淀粉酶系统。
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确定苹果多酚中的原花青素B2是具有α-淀粉酶抑制作用的核心成分。
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通过多种技术结合，阐明了原花青素B2的抑制机制。
引言
糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，其特点是由于胰腺功能异常或胰岛素抵抗导致高血糖，进而引起葡萄糖积累并损害多个器官[1]、[2]。作为一项全球性的公共卫生问题，它与淀粉消化密切相关，而淀粉消化正是导致血糖波动的主要原因。易消化的淀粉会引发血糖急剧上升，加重糖尿病患者的胰腺负担[3]。因此，抑制α-淀粉酶（PPA）的活性是控制糖尿病的有效方法。虽然阿卡波糖和米格列醇等药物能够降低餐后血糖，但由于成本高昂以及可能带来的胃肠道副作用，其使用受到限制[4]、[5]。因此，寻找能够抑制消化酶的天然生物活性成分已成为研究的重要方向。
近年来，某些植物来源的多酚被认为可通过抑制消化酶的活性来发挥降血糖作用。中国苹果的种植规模很大，产量稳定且较高。相关研究表明，新鲜苹果中可提取的多酚总量相当可观，大约在2.3到3.6克/千克之间[6]。此外，青苹果中的苹果多酚含量约为新鲜苹果的十倍[7]。苹果多酚具有多种生理功能，包括清除自由基、抑制炎症、抗肿瘤以及降血糖作用[8]、[9]、[10]、[11]。这些结果表明，苹果多酚有望成为控制血糖的天然有效物质。然而，目前尚未确定苹果多酚中具有PPA抑制作用的特定生物活性成分，因此有必要进一步探究其背后的抑制机制。
苹果多酚的组成十分复杂，化学性质也存在较大差异。传统的生物活性筛选方法效率低下、特异性差、重复性不足，且流程复杂、成本高昂，无法满足现代药品研发对快速、精准、高通量检测的需求。酶固定化技术通过将酶固定在特定载体上，显著提高了酶的稳定性、回收率以及储存性能[12]。戊二醛是一种常用的交联剂，它能通过与酶的氨基结合来实现固定，但存在细胞毒性高且稳定性不足的问题[13]。近年来，诸如吉尼宾这类天然交联剂因具有较高的生物相容性、出色的稳定性以及较低的细胞毒性而备受关注[14]。吉尼宾是一种环状环烯醚萜类化合物，其作用方式与戊二醛类似，但能与蛋白质中的伯胺形成稳定的共价键。在固定化系统中，吉尼宾表现出明显优势：固定在壳聚糖上的角蛋白酶在经过10次循环后仍能保持50%以上的活性，在4摄氏度下保存30天后活性仍接近90%[15]；固定在经吉尼宾改性的壳聚糖上的果胶酶在60摄氏度下放置5小时仍能保持60%的活性，而游离酶的活性则会迅速下降[16]。这些研究为吉尼宾在酶固定化技术中的应用提供了理论依据。
为了提高固定化效率，我们对固定化参数进行了优化。首先，我们将PPA固定在经过吉尼宾交联的壳聚糖微球上，以此捕获苹果多酚中的PPA抑制剂。随后，利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对这些分离得到的化合物进行鉴定。通过体外抑制试验和分子对接技术，进一步确认了其中最具PPA抑制活性的成分。最后，通过酶动力学分析、多光谱技术以及分子动力学模拟，验证了该成分的实际应用价值及其抑制效果。
章节要点
材料
PPA（猪胰腺来源，活性为40–60 U/mg）购自中国上海的麦克林化学有限公司。阿卡波糖由中国上海的源恩生物科技有限公司提供。3,5-二硝基水杨酸从中国上海的阿拉丁化学有限公司购买。色谱级乙腈则由赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供。苹果多酚（总多酚含量≥70%，重量百分比）则购自天津建峰天然产物研究与开发有限公司。
苹果多酚对PPA的抑制能力
图2展示了不同浓度下苹果多酚和阿卡波糖对PPA活性的浓度依赖性抑制效应。在本实验中，阿卡波糖被用作阳性对照。半最大抑制浓度（IC??）可用于反映抑制剂抑制酶活性的能力。通过多元非线性拟合，计算得出苹果多酚的IC??为1.20 ± 0.15毫克/毫升，而在相同实验条件下的阿卡波糖的IC??则为0.07 ± 0.19毫克/毫升。这一数值表明，
结论
本研究建立了一种高效的筛选平台，将该平台与GP交联的壳聚糖固定化PPA技术以及HPLC-Q-TOF-MS/MS技术相结合。从苹果多酚中鉴定出了四种潜在的PPA抑制剂，其中原花青素B2的抑制效果最为显著。通过动力学分析、光谱分析、ITC分析以及分子动力学模拟，发现原花青素B2能够以可逆且竞争性的方式抑制PPA的活性。它能够自发地与酶结合，改变酶的构象并形成稳定的复合物，从而有效抑制淀粉的消化，帮助控制血糖水平。
作者贡献说明
曹晓娜：论文撰写——初稿撰写、数据整理、概念构思。 唐盖玲：结果可视化、实验验证、研究深入分析。 范星：实验验证、概念构思。 高欣宇：实验验证、软件应用。 王天鑫：实验验证、项目监督。 张晓涵：论文撰写——审阅与编辑、实验方法设计。 王文杰：论文撰写——审阅与编辑、概念构思。 王浩：项目监督、项目管理工作协调、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
Xiaona Cao|Gailing Tang|Xing Fan|Xinyu Gao|Tianxin Wang|Xiaohan Zhang|Wenjie Wang|Hao Wang
