用于遗传性额颞叶痴呆体外建模的恒河猴iPSCs的可重复生成与稳定维持

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Replicable generation and stable maintenance of rhesus macaque iPSCs for in vitro modeling of genetic frontotemporal dementia

　　

在威斯康星国家灵长类研究中心，研究人员鉴定了一个携带与额颞叶痴呆（FTD）相关的微管相关蛋白tau（MAPT）R406W突变的恒河猴家族。从这些猴子中衍生的恒河猴诱导多能干细胞（RhiPSCs）为体外建模以及与MAPT R406W人类携带者来源的细胞进行比较提供了独特的机会。在此，研究人员报告了一种符合国际干细胞研究学会（ISSCR）标准的可重复生成RhiPSCs的方法，以支持FTD-MAPT R406W的体外建模。研究人员的逐步方法确定了成纤维细胞衍生、成纤维细胞重编程为RhiPSC以及RhiPSC在持续培养中维持的高效方法。为了从MAPT野生型（WT）和R406W猴子中衍生成纤维细胞，需要结合手动处理和过夜酶消化，以最大化可用于重编程的低传代成纤维细胞数量。使用仙台病毒载体与oriP/EBNA1附加体质粒进行成纤维细胞重编程为RhiPSC的比较显示，后者效率最高。对oriP/EBNA1重编程的电穿孔条件进行了优化，以最大化质粒摄取和细胞存活。最终，从4只供体恒河猴（n=2 WT，n=2 R406W；每只供体两个克隆系）衍生了8个RhiPSC系，并根据ISSCR标准进行了全面表征。RhiPSC的干性和遗传稳定性最佳维持在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的Universal Primate Pluripotency Stem Cell培养基中，而非补充了IWR1的Essential 12培养基，后者会导致细胞遗传学异常。使用单层方案生成了恒河猴神经祖细胞，并在分化21天后表达PAX6和NESTIN。研究人员可靠的方法将有助于寻求衍生RhiPSC用于临床前研究的实验室。总体而言，从MAPT R406W携带者生成的RhiPSC将成为评估跨灵长类物种tau相关神经退行性变分子机制的关键资源。

额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）是60岁以下患者中最常见的痴呆形式，其中微管相关蛋白tau（microtubule-associated protein tau, MAPT）基因的R406W常染色体显性突变与遗传性FTD密切相关。现有研究利用人类诱导多能干细胞（human iPSCs, hiPSCs）已揭示MAPT R406W突变导致tau裂解增加、错误折叠tau积累、微管不稳定、线粒体运输障碍及功能障碍，并影响钙稳态和突触功能等分子通路。然而，跨物种比较研究对理解tau病理的进化保守性至关重要。威斯康星国家灵长类研究中心（WNPRC）鉴定了一个携带与人类FTD相同MAPT R406W突变的恒河猴家族，为体外建模提供了独特资源。然而，恒河猴iPSCs（rhesus iPSCs, RhiPSCs）的衍生和维持方法远不如人类iPSCs成熟，现有研究常缺乏可重复性，且多仅产生单一细胞系，未充分遵循国际干细胞研究学会（International Society for Stem Cell Research, ISSCR）的报道标准。因此，开展本研究旨在建立一种可重复的、符合ISSCR标准的RhiPSC生成与维持方法，以支持FTD-MAPT R406W的体外建模，并为后续体内临床前研究提供细胞资源。该论文发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。

研究人员为开展研究采用的关键技术方法包括：1）皮肤活检组织经手动剪切和过夜酶消化（胶原酶I和DNase I）联合处理，从MAPT野生型（wild type, WT）和R406W恒河猴（共4只供体，年龄1.1–19岁）中分离低传代（≤P2）成纤维细胞；2）利用Neon转染系统优化电穿孔程序（共24个预设程序），通过评估eGFP表达和细胞存活率筛选最佳条件，并使用非整合oriP/EBNA1附加体质粒（含KLF4、SOX2、POU5F1、c-MYC、NANOG、LIN28A、SV40LT及miR-302/367簇）进行成纤维细胞重编程；3）RhiPSCs在Universal Primate Pluripotency Stem Cell（UPPS）培养基中于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）饲养层上维持，并通过碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光、流式细胞术、核型分析、短串联重复序列（short tandem repeat, STR）认证、支原体及病毒筛查和畸胎瘤形成实验进行ISSCR标准表征；4）采用单层方案将RhiPSCs于21天内分化为恒河猴神经祖细胞（rhesus neural progenitor cells, RhNPCs），并通过免疫荧光检测PAX6和NESTIN表达。

研究结果部分主要结论如下：
3.1 成纤维细胞衍生：与单独手动处理相比，手动加酶消化法显著缩短了从组织贴壁到首次传代的时间（平均5.3天对比19天），且能获得更多低传代（≤P2）成纤维细胞。值得注意的是，MAPT R406W来源的成纤维细胞在P3-P4代出现形态异常（增大、多核化）并停止增殖，而WT细胞形态正常。
3.2 成纤维细胞重编程为RhiPSCs
3.2.1 仙台病毒重编程：三次尝试均未成功。前两次因细胞过度增殖导致无RhiPSC集落出现；第三次虽获得集落，但传代5-6次后多能性丧失并分化，且无法稳定冻存复苏。
3.2.2 附加体质粒重编程与电穿孔优化：经过13次试验，通过优化电穿孔程序（最终确定Neon程序#5、#14、#15、#16、#20、#23、#24为最佳）、添加额外重编程因子（NANOG、LIN28A、SV40LT）并改用UPPS培养基，成功从4只供体恒河猴（W4、M4、W6、M6）中获得8个RhiPSC系（每只动物2个克隆系）。关键变量包括电穿孔条件、细胞铺板密度（1.0–2.5 × 10⁵ 细胞/cm²）以及培养基选择。
3.3 RhiPSC培养条件优化：在MEF、Matrigel和Vitronectin三种基质上，结合UPPS培养基添加CEPT（chroman 1, emricasan, polyamines, trans-ISRIB）或Y-27632进行克隆效率实验。结果显示，MEF加CEPT组合的克隆效率最高（p=0.014），且MEF基质显著优于Matrigel和Vitronectin（p=0.065，43.8%变异）。
3.4 RhiPSC表征与维持：所有8个RhiPSC系均保留MAPT WT或R406W基因型，呈现典型多能干细胞集落形态，碱性磷酸酶阳性，表达多能性基因（POU5F1、NANOG、SOX2、KLF4、MYC、LIN28A）和蛋白（OCT4、SOX2、NANOG），且流式细胞术证实阳性率>93%。附加体质粒在传代后丢失（P14-P18检测阴性）。STR认证确认细胞来源，支原体及病毒（Herpes B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴T淋巴细胞病毒、猴逆转录病毒）均阴性。核型正常（雌性42,XX或雄性42,XY）。所有细胞系在MEF饲养层上于UPPS培养基中可维持未分化状态超过30代（4个月），并能形成含三胚层（内胚层、中胚层、外胚层）的畸胎瘤。
3.5 RhNPC衍生与表征：每只动物至少一个克隆系经21天单层分化后，RhNPCs表达细胞质NESTIN和PAX6（部分系呈现细胞核和细胞质PAX6表达）。其中W6 Clone 5.07的RhNPCs形态异常且仅显示细胞质PAX6，而另一克隆Clone 15.03则显示正常核表达。OCT4在分化后不表达。

讨论部分总结：本研究表明，非整合oriP/EBNA1附加体质粒重编程可稳定生成RhiPSCs，关键变量包括额外重编程因子（LIN28A、NANOG、SV40LT）、电穿孔条件优化及铺板密度。UPPS培养基联合MEF饲养层是维持RhiPSC干性和遗传稳定性的最佳组合。与仙台病毒相比，附加体质粒方法在效率、稳定性和可重复性上更优。MAPT R406W成纤维细胞在P3-P4代出现异常，提示tau突变可能影响核分裂，值得进一步研究。PAX6细胞质表达可能源于氧化应激或活跃合成，需系统评估。本工作首次按照ISSCR标准全面表征了8个RhiPSC系，并强调了在非人灵长类iPSC研究中纳入病毒筛查（如Herpes B病毒）和标准化报道的重要性。结论部分翻译：总体而言，这些结果证明了oriP/EBNA1附加体质粒重编程用于生成RhiPSC的可重复性。有助于可重复生成RhiPSC的关键变量包括添加额外重编程因子（即LIN28A、NANOG和SV40LT）、优化电穿孔条件以及转染成纤维细胞的铺板密度。确定了培养基（UPPS）和基质（MEFs）用于未分化且遗传稳定的RhiPSC的持续培养。所有8个RhiPSC系（MAPT WT n=4，R406W n=4）均根据ISSCR标准进行了全面表征，每只动物至少有一个克隆系在21天内分化为RhNPC，以支持MAPT R406W FTD的体外建模。这些细胞将成为理解MAPT R406W突变如何驱动疾病、识别生物标志物以及在珍贵猴子中进行临床前测试前测试新型疗法的重要资源。