《Frontiers in Microbiology》：Methodological bias shapes the interpretation of the urinary microbiome in low-biomass systems
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尿微生物组（urobiome）的识别挑战了尿路无菌的长期范式，揭示了与泌尿健康及疾病相关的多样微生物群落。然而，尿微生物组的表征在不同研究中仍存在高度异质性，这主要归因于尿液样本的低生物量特性及方法学偏倚的显著影响。本综述中，研究人员探讨了样本采集方法、污染动
尿微生物组（urobiome）的识别挑战了尿路无菌的长期范式，揭示了与泌尿健康及疾病相关的多样微生物群落。然而，尿微生物组的表征在不同研究中仍存在高度异质性，这主要归因于尿液样本的低生物量特性及方法学偏倚的显著影响。本综述中，研究人员探讨了样本采集方法、污染动态、DNA提取方案、测序策略及生物信息学流程等因素如何塑造微生物谱型，并导致微生物组-疾病关联研究结果的不一致。研究人员进一步讨论了传统培养依赖性诊断方法的局限性——其无法检测到测序方法鉴定出的多种微生物，并强调需要建立标准化、污染感知及功能导向的研究框架。最后，研究人员探索了整合多组学策略的潜力，以提升尿微生物组研究在尿路健康与疾病领域的可靠性、可重复性及应用相关性。
1 引言
长期以来，受传统培养依赖性微生物学技术局限性的影响，尿路感染症以外状态下尿路被视为无菌环境。非培养技术的开发与应用挑战了这一认知，证实尿液中存在多样且动态的微生物群落，即尿微生物组（urobiome）。随着培养技术的进步，如扩增定量尿培养（expanded quantitative urine culture, EQUC），以及基因组学方法的应用，包括用于细菌谱分析的16S rRNA基因测序和作为真菌特征主要标记物的内部转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序，研究人员不仅在尿路感染患者中，也在无症状人群中检测到微生物，从而将尿路重新定义为具有生物学活性的微生物生态位，而非无菌腔室。尽管取得上述进展，尿微生物组的表征在不同研究中仍高度可变。尿液样本报告的微生物谱差异不仅源于宿主相关因素——如性别、激素状态、年龄及解剖学差异，也与研究方法学密切相关，包括样本采集策略和测序技术等。此外，测序方法检测到的许多微生物无法通过标准临床培养回收，凸显了传统诊断框架的局限性，提示历史上大量尿路微生物未被检出。这些局限性对微生物学解读和临床转化具有重要意义。越来越多的证据表明，微生物群落结构与尿路感染、尿失禁、膀胱过度活动症及间质性膀胱炎等疾病存在关联。然而，这些关联的稳定性和生物学意义仍不明确，尤其在未明确考虑方法学变异的情况下。因此，一个核心问题随之产生：当前方法学在多大程度上捕获了真实的生物学信号，又在多大程度上引入了系统性偏倚？本综述中，研究人员探讨了方法学偏倚如何塑造尿微生物组研究中的微生物检测与生态学解读，分析了该变异性对微生物学解读和临床转化的影响，并展望了迈向更标准化、功能导向的分析框架的发展方向。
2 低生物量尿微生物组研究的方法学限制
2.1 作为低生物量微生物系统的尿微生物组
低生物量微生物系统的动态范围狭窄，测量信号可接近检测限，因此会不成比例地受研究方法学设计的影响。在此背景下，下一代测序（next-generation sequencing, NGS）的敏感性是一把双刃剑：其虽能实现低丰度核酸的检测，但同时增加了污染物序列被采样并保留于最终读段集的可能性，从而放大了可能并非源自生物标本的信号。当微生物载量较低时，污染物DNA可主导测序结果，扭曲表观多样性和群落结构。因此，尿微生物组研究的结果必须被视为生物学与测量耦合系统的观测值，而非稳定、独立微生物群落的直接读数。类似的解释挑战在其他低生物量生态位中已有充分记载，例如肺微生物组研究已表明，低细菌载量和易污染的采样方式可塑造推断的微生物群落。胎盘微生物组研究则强调了即使采用复杂工作流程，微生物信号仍可能与污染对照难以区分的风险。对于尿微生物组而言，这些问题因解剖位置邻近高生物量区域而加剧，增加了外部信号进入低生物量尿液测量的概率。综上，尿微生物组研究中的技术变异性并非测序后可完全“平均消除”的次要干扰，而是决定了如何从尿液数据推断生物学叙事的结构性约束。
2.2 分析全流程中的方法学偏倚来源
方法学偏倚贯穿于尿微生物组工作流程的每一阶段，从样本采集到生物信息学分析，并在微生物群落的检测与解读中发挥决定性作用。因此，方法学选择可独立塑造观测到的微生物信号及其呈现方式。即使生物标本名义上具有可比性，分析实施的差异仍可导致同一基础生物材料的表征结果出现分歧。采样方法是变异的主要来源，其直接决定了被分析的微生物组分。比较研究显示，自然排尿、中段尿和导尿样本产生的微生物谱存在显著差异，α多样性和β多样性均随采集策略而变化。自然排尿样本常包含尿道及尿道周围微生物群的贡献，而导尿样本虽可减少但无法完全消除外源性污染。这些差异无法通过下游计算方法完全校正，表明采样偏倚无法事后修正。实验室试剂和工作流程的污染是低生物量微生物组研究中另一公认偏倚来源。提取试剂盒和PCR试剂中的DNA含量随批次变化，可显著影响测序结果；在低生物量样本中，污染物序列可能占总读段的很大比例，导致分类群的错误检测和多样性估计虚高。近期多实验室分析表明，即使认知不断提升，污染仍是持续存在的挑战。因此，系统纳入阴性对照和采用污染感知的分析框架至关重要。另一个局限源于对DNA检测的依赖，其无法区分活微生物、死细胞及细胞外DNA。这一局限在尿路中尤为相关，因为抗菌治疗后残留的微生物DNA可能持续存在，使得测序检测并不必然反映生物学活性或临床相关性。虽然已有研究提出碘化丙啶单叠氮化物处理等方法以解决此问题，但其性能仍不稳定，且强烈依赖于样本组成和生物量。因此，微生物DNA的检测不能直接解释为活性定植的证据。测序策略引入了另一层方法学差异。代谢条形码方法（包括用于细菌谱分析的16S rRNA基因测序和用于真菌表征的ITS测序）与鸟枪法宏基因组学相比，因引物偏倚、扩增效率及分类学分辨率差异可产生显著不同的微生物谱。鸟枪法宏基因组学虽能提供更高的分类学分辨率和微生物功能潜力表征，但更易受宿主DNA干扰，且需要更大的测序深度，限制了其在低生物量环境中的适用性。因此，采用不同测序策略得出的发现若不经方法学背景的审慎考量，无法直接比较。生物信息学处理引入了额外的变异性。参考数据库（如SILVA、Greengenes和RDP）的差异可导致分类学注释不一致及多样性指标波动，即使分析相同的数据集亦是如此。此外，参考基因组不完整和注释错误进一步增加了微生物分类群及功能基因（包括抗菌药物耐药决定因子）准确鉴定的难度。这些问题意味着计算设计可直接塑造从同一基础测序读段得出的生物学结论。不同研究中观察到的差异可能既反映了分析设计的变异，也反映了潜在微生物生态学的差异，从根本上限制了尿微生物组研究结果的可重复性和可比性，因为多个工作流程阶段的方法学选择可独立重塑报告的微生物谱。因此，尿微生物组的解读必须置于完整的分析工作流程背景下，而不能将不同研究的结果视为直接可比。
2.3 从微生物学不确定性到临床意义
缺乏一致的尿路核心微生物群（urobiota）意味着不同研究报告的显性分类群和群落结构各异。这种不稳定性不仅反映了生物学多样性，也与塑造微生物检测组分及分类的方法学效应相符。从概念上讲，尿液是一个动态腔室，流动、稀释和排尿动力学持续重塑微生物景观，这与粪便等更静态的高生物量生态位不同；当研究设计存在差异时，这种动态性很可能加剧了解读的不确定性。临床研究面临类似挑战：症状组与无症状组之间的表观重叠可能十分显著，限制了单一显性分类群作为稳定生物标志物的应用价值。菌群失调的定义在不同研究中也不一致，基线和阈值的差异降低了研究的可重复性和预测价值。这些生物学模糊性转化为诊断不确定性。传统尿培养难以捕捉尿微生物组相关的复杂性，因其倾向于支持快速生长的生物体，且常遗漏多微生物感染或苛养菌。实践中，具有临床意义的信号可能被误判为污染，导致微生物组研究与临床预期之间存在转化鸿沟。非培养方法进一步增加了解读难度，因其无法可靠区分活菌与死菌，即检测到的DNA可能并不对应活动性感染或具有临床意义的微生物过程。方法学偏倚可能放大表观的组间差异。即使报告了统计学显著的分类群或群落模式，这些差异也可能反映的是分析设计（如检测灵敏度、参考注释分配和低生物量随机性），而非患者表型间的生物学差异。多项研究共同表明，方法学变异性可出现在尿微生物组分析工作流程的每一个阶段，从尿液采集、样本处理到测序和生物信息学解读。具体而言，尿液采集方法（如自然排尿中段尿与导尿膀胱尿、首段尿与中段尿、膀胱镜采集尿、膀胱穿刺尿与自然排尿尿及采集装置/方案）可显著改变丰富度、α/β多样性及检测到的分类群，自然排尿样本常捕获尿道/泌尿生殖区污染，而导尿或膀胱入路样本可能更好地反映膀胱相关群落。储存与保存条件（如储存温度、储存时间、防腐剂使用、采集时间点/日间差异）影响微生物稳定性及低丰度分类群的检测，标准化采集后处理对提升可重复性至关重要。尿液体积与预处理条件（如处理体积、离心速度/时间、沉淀条件）影响DNA产量、微生物回收率及下游测序性能，在低生物量样本中尤为关键。DNA提取方法（如提取试剂盒选择、裂解化学试剂、方案改良）可通过差异回收效率、试剂污染和裂解偏倚产生不同的微生物谱。宿主DNA去除策略可改善鸟枪法宏基因组学中的微生物回收率，但增加了工作流程复杂性并可能影响群落代表性。扩增子选择与16S区域（如16S rRNA靶区、单扩增子与多扩增子重建）强烈影响分类学分辨率和检测到的群落结构，且16S谱分析仅限于细菌群落分析。测序策略（如16S rRNA基因测序与鸟枪法宏基因组学）各有优劣：16S所需输入量更低，更适用于广泛的细菌谱分析；鸟枪法宏基因组学提供更高分辨率和功能推断，但对宿主DNA干扰和测序深度要求更敏感。检测平台（如培养法与测序法）互补但不可互换，各自检测尿微生物组的不同组分且受不同偏倚影响。生物信息学流程（如QIIME 2、NG-Tax、Mothur的选择；基于操作分类单元OTU与基于扩增子序列变体ASV的处理；聚类/过滤阈值设定）影响多样性估计、聚类和结果的可解释性。参考数据库（如SILVA、Greengenes、NCBI 16S参考集）的选择可改变种水平注释和比较解读，凸显了透明、统一的注释框架的必要性。
3 迈向标准化和功能导向的尿微生物组研究
样本采集标准化是尿微生物组研究中杠杆效应最高的干预措施，因其决定了进入工作流程下游阶段的生物材料属性，计算层面的协调无法挽救因采集方法不一致而产生的谱型。比较研究证实，自然排尿、中段尿和导尿样本产生的微生物组成存在显著差异。导尿采样可减少外源性污染但无法完全消除。在研究级研究中，若伦理和临床条件允许，应优先选择导尿采集；而在大规模研究中，自然排尿采样仍更具可行性。明确规定的最小尿液体积阈值，以及对采集途径和方案的详细记录，应成为强制报告标准以提升结果可解释性。在低生物量尿液中，代谢条形码方法仍是最可行的首选方案，因其所需输入材料远少于鸟枪法宏基因组学，且受宿主DNA干扰的限制更小。然而，文库制备和测序过程中的方法学选择（包括引物和靶区选择、扩增条件、测序深度及平台选择）可显著影响微生物回收率和分类学分辨率。鸟枪法宏基因组学可提供更高的分类学分辨率和直接的功能推断，但其实际应用仅当可获得足够尿液体积，并采用宿主DNA去除策略以减轻强宿主背景信号时才可行。因此，纳入适当对照、模拟群落及透明报告测序参数的标准化工作流程，对提升可重复性和跨研究可比性至关重要。一种务实的策略是采用混合设计：利用代谢条形码方法表征队列的广泛群落结构，并对尿液体积和测序深度足以支持稳健微生物回收的特定标本应用鸟枪法宏基因组学。污染感知分析在尿微生物组研究中应被视为强制性要求而非可选步骤。低生物量尿液测序尤其易受试剂、实验室环境和样本处理过程中污染物DNA的影响，后者可占检测信号的很大比例。因此，每项研究设计均应纳入提取、扩增和文库制备阶段的阴性对照，并明确报告这些对照如何指导下游过滤决策。即使是旨在控制污染的工作流程，也可能在不同研究中心产生分歧结果，这进一步强化了统一参考物质和共享模拟群落的必要性。虽然污染感知工作流程对提升数据可靠性至关重要，未来的进展还需超越描述性分类谱分析，转向功能表征。代谢条形码和鸟枪法宏基因组学均可提供遗传潜力信息，但无法完全捕获微生物活性、基因表达或代谢产物输出。多组学整合——将宏基因组学与宏转录组学、代谢组学及培养验证相结合——为连接微生物组成与功能及临床相关性提供了路径。然而，在低生物量尿液中的应用技术要求较高：常规采样条件下所需的输入体积和可实现的测序深度常限制多组学的可行性，且耐受这些约束的方案仍需进一步开发。宿主相关和环境元数据是提升跨研究可解释性尚未充分利用的手段。年龄、性别、激素状态、合并症及抗生素暴露等因素可能以复杂且情境依赖的方式影响尿路微生物组成，但尚未被一致纳入研究设计或分析框架。若无统一的最低元数据标准，将宿主驱动的变异与方法学伪影分离及跨人群转化研究发现仍将困难重重。涵盖性别、年龄、绝经状态、近期抗生素使用和尿路诊断的最低报告标准将实质性提升可比性。除方法学统一外，标准化工作还应考虑尿微生物组区别于其他低生物量生态系统的生物学特征。与侵入性腔室不同，尿液允许对同一受试者进行无创纵向采样，从而可利用个体内基线支持解读。尿微生物组还与常见、高负担的临床疾病——尿路感染、尿失禁、膀胱过度活动症和间质性膀胱炎——直接相关，这为方法学改进提供了明确的转化依据。尿路微生物载量和群落组成随性别、激素状态和泌尿外科疾病系统性变化，支持分层分析。综上，本文综述的证据表明，仅靠提升可重复性不足以推动该领域发展。标准化必须伴随功能表征和情境化解读，以区分方法学变异与真实生物学信号。一个整合统一分析流程、多组学方法和宿主相关元数据的框架，可能为鉴定尿微生物组中具有功能和临床意义的微生物特征提供路径。未来的进展将取决于在整个工作流程中整合方法学严谨性与生物学解读。若无涵盖采样标准化、污染感知分析、功能性多组学整合及一致宿主元数据报告的协同努力，研究可能仅在技术层面可重复，却在生物学层面模糊不清。共享参考物质、模拟群落和统一的分析工作流程是实现有意义的跨研究比较、减少分析设计所致分歧的关键一步。在方法学变异得到明确考量之前，尿微生物组仍将是一个部分解析的系统，其表征结果受分析设计的影响程度不亚于潜在的生物学现实。
