使用噬菌体靶向非结核分枝杆菌：体外宿主范围测定方法的优化

《BMC Microbiology》：Targeting nontuberculous mycobacteria with phages: optimization of in vitro host range assays

　　

分枝杆菌噬菌体的临床实施受到标准化体外方法缺乏和宿主范围结果不一致的阻碍，限制了对其它治疗潜力的可靠评估。非结核分枝杆菌（NTM）感染通常难以治疗，强调了对抗生素替代或辅助策略的迫切需求。为促进可重复的转化研究，对体外测定条件的详细和系统性理解至关重要。在本研究中，研究人员全面评估了常用液体和固体培养基在支持多种NTM菌株生长及后续噬菌体应用中的适用性。研究人员比较了三种液体培养基及相应固体琼脂上的细菌生长动力学、聚集倾向以及噬菌体诱导裂解（包括斑块形成）的效率。研究结果表明，基于Middlebrook的培养基和琼脂始终支持稳健的NTM生长，减少细菌聚集，并实现可重复的噬菌体活性检测，尽管成本和劳动要求更高，但优于基于TSB（胰酶大豆肉汤）的替代方案。这些发现为体外NTM培养和噬菌体检测提供了标准化框架，这对于可靠评估宿主范围、感染动力学以及基于分枝杆菌噬菌体的疗法开发至关重要。

非结核分枝杆菌（NTM）感染，尤其是由鸟分枝杆菌复合体（MAC）和脓肿分枝杆菌复合体（MABC）引起的感染，对免疫缺陷或肺部疾病患者构成严重威胁，其治疗因固有和获得性耐药而极为困难。分枝杆菌噬菌体作为抗生素的辅助疗法具有潜力，但缺乏标准化的体外检测方法导致宿主范围结果不一致，阻碍了临床转化。为此，研究人员在《BMC Microbiology》发表研究，系统评估了常用培养基和铺板方法对NTM生长及噬菌体检测的影响，旨在建立可重复的标准化框架。

研究人员首先比较了三种液体培养基——Middlebrook/OADC（添加油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶）、TSB/甘油和TSB/酵母提取物——对六种临床NTM分离株（包括慢生长的MAC和快生长的MABC及耻垢分枝杆菌）的生长支持能力。这些菌株来自德国歌德大学医院微生物研究所、莱布尼茨研究所DSMZ和比利时布鲁塞尔Queen Astrid军事医院，均具有临床来源。通过分光光度法监测生长动力学（OD₆₀₀），并利用过滤法量化细菌聚集程度。随后，在相应固体琼脂上采用Top Agar（TA，即双层琼脂覆盖法）和Direct Plating（DP）两种铺板形式，通过斑点试验评估噬菌体8UZl和D29的裂解活性，统计斑块形成单位（PFU）和裂解时间。所有实验均包含至少四个生物学重复，数据采用逻辑生长模型拟合和方差分析。

**Comparative growth kinetics under different liquid culture conditions**：通过生长曲线分析，所有培养基均支持各菌株生长，但慢生长菌株在TSB培养基中滞后相延长。拟合最大OD₆₀₀（Y_M）、生长时间（X_int）和最大生长速率（μ_max）显示，物种间差异显著，但培养基间无统计学显著差异，仅鸟分枝杆菌胞内亚种在TSB/甘油中Y_M显著降低（p<0.01）。

**Bacterial clumping behavior**：针对耻垢分枝杆菌和脓肿分枝杆菌脓肿亚种的聚集分析表明，Middlebrook/OADC液体培养基中细菌聚集显著低于两种TSB培养基（p<0.02），而OD₆₀₀无显著差异，证明聚集程度是培养基的独立特征。

**Method comparison for spot assays**：通过分类热图总结噬菌体8UZl的裂解活性，发现Middlebrook/OADC琼脂上产生可计数斑块的比例最高，而TSB培养基中更多出现无斑块的裂解区或完全无活性。TA方法在所有培养基中均比DP方法产生更多可计数斑块条件，尤其对慢生长NTM。

**Titer-dependent detection of lytic activity of phage 8UZl**：基于滴度稀释系列，TA方法检测到裂解活性的灵敏度更高，即能在更低噬菌体滴度下观察到裂解，而DP方法常丢失高稀释度下的信号。不同培养基间总体灵敏度差异不显著，但Middlebrook/OADC在鸟分枝杆菌嵌合亚种上支持更广的稀释检测范围。

**Visualization of countable plaques across different conditions for phage 8UZl**：对可计数斑块条件的定量分析显示，TA方法产生的斑块出现时间更早、PFU值分布更窄，表明感染动力学更同步；DP方法则延迟且变异更大。但两种方法的总PFU值在可比较条件下相当，说明铺板形式主要影响检测可靠性而非复制能力。

**Validation in rapidly growing mycobacteria using phage D29**：用宿主范围更窄的D29噬菌体在耻垢分枝杆菌和脓肿分枝杆菌脓肿亚种上重复实验，结果与8UZl一致，证实了上述发现的普适性。

讨论部分指出，所有培养基均支持NTM液体培养，但Middlebrook/OADC在减少聚集和检测可重复性上最优，尽管成本较高；TSB培养基经济但可靠性差，尤其对慢生长菌株。TA方法相比DP更稳健，但DP在特定条件下（如鸟分枝杆菌嵌合亚种在TSB中）偶有优势。研究强调了细菌聚集对OD₆₀₀定量的干扰，以及无斑块裂解作为宿主范围筛查信息的价值。结论部分翻译如下：本研究基于多个生物学重复和两种不同分枝杆菌噬菌体，对体外噬菌体检测的相关变量进行了全面评估。基于Middlebrook/OADC的流程结合了多项优势，包括可靠培养大多数测试NTM物种以及减少液体培养中的聚集，但成本较高。基于TSB的方法更经济，但可靠性较低，尤其对慢生长NTM。鉴于临床NTM分离株之间噬菌体感染谱的显著异质性以及由此导致的个性化治疗需求，标准化仍具挑战性。尽管如此，本研究提出的比较框架为分枝杆菌噬菌体研究中的实验室准备和流程选择提供了实用指导。