Viperin通过抑制病毒RdRP活性抑制鹅星状病毒2型复制

《Veterinary Research》：Viperin suppresses goose astrovirus type 2 replication through inhibition of viral RdRP activity

　　

鹅星状病毒2型（GAstV-2）感染可导致雏鹅内脏痛风，在3–15日龄雏鹅中死亡率较高。尽管自2018年首次发现该病毒以来已进行了广泛研究，但宿主针对GAstV-2的天然免疫防御机制仍不完全清楚，阻碍了有效疫苗和治疗方法的开发。在此，研究人员证明了GAstV-2感染在体外和体内均上调Viperin表达，提示Viperin可能作为宿主限制因子发挥作用。进一步研究表明，病毒ORF2的P2结构域有助于刺激Viperin表达。过表达和敲低实验证实Viperin对GAstV-2具有抗病毒活性。然而，Viperin并不影响病毒吸附或内化。机制研究表明，Viperin通过依赖其S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结构域的方式减弱病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，从而抑制GAstV-2。SAM结构域被发现可促进3'-脱氧-3',4'-二脱氢-胞苷-5'-三磷酸（ddhCTP）的产生，这与RdRp活性降低和病毒复制抑制相关。此外，肌肉注射ddhCTP可降低雏鹅死亡率、病毒载量，并减轻GAstV-2诱导的肾脏、脾脏和肝脏病理损伤。总之，这些发现将Viperin鉴定为针对GAstV-2的关键宿主限制因子，并突出了其作为抗病毒策略靶点的潜力。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
鹅星状病毒2型（GAstV-2）是一种无包膜、正链单链RNA病毒，基因组约7.2 kb，包含5′-非翻译区（5′-UTR）、三个开放阅读框（ORF1a、ORF1b和ORF2）及3′-UTR。GAstV-2主要感染3–15日龄雏鹅，死亡率可达5%–50%，感染雏鹅通常表现为内脏和关节尿酸盐沉积、肾脏肿胀、肝脏空泡变性及坏死，导致养鹅业重大经济损失。目前尚无商品化药物或疫苗用于控制GAstV-2。由于多数分离株在鸡肝癌细胞（LMH细胞）中不产生细胞病变效应（CPE）且病毒滴度低，GAstV-2感染被认为具有自限性，细胞天然免疫在抑制病毒复制与传播中起关键作用。干扰素（IFN）通过激活数百种干扰素刺激基因（ISG）发挥抗病毒作用，但GAstV-2感染后宿主天然免疫防御机制仍不完全清楚，阻碍了疫苗与药物开发。此前RNA测序分析发现，GAstV-2感染在原代鹅肾小管上皮细胞中诱导Viperin（又名RSAD2，属于自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶超家族）高水平表达。Viperin是一种进化保守的I型ISG，对多种病毒（如西尼罗病毒WNV、登革病毒DENV、人免疫缺陷病毒HIV）具有抗病毒活性，但对某些病毒（如HCMV）却促进感染。Viperin是否抑制GAstV-2复制及其分子机制尚不清楚，因此开展本研究。

**研究内容与结论**
研究人员通过体外细胞感染、体内雏鹅实验、过表达与敲低、双荧光素酶报告系统、液相色谱-质谱（LC–MS）等方法，系统阐明Viperin通过其SAM结构域催化产生ddhCTP，抑制病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，从而限制GAstV-2复制。肌肉注射ddhCTP可降低雏鹅死亡率、病毒载量并减轻组织病理损伤。该研究将Viperin确定为针对GAstV-2的关键宿主限制因子，为抗病毒策略提供新靶点。论文发表在《Veterinary Research》。

**主要关键技术方法**
- 细胞与病毒：使用LMH细胞（唯一支持GAstV-2复制的细胞系）和原代鹅肾小管上皮细胞（GRTE细胞）；GAstV-2菌株JSHA（GenBank: MK125058）。
- 质粒构建与转染：构建Viperin-Flag、GAstV-2 ORF1a/1b/ORF2及其截短体（S、P1、P2）的HA标签表达质粒，以及Viperin突变体（Δ1–44、Δ250–354、DCA）；使用Lipofectamine 3000转染。
- qPCR与Western blot：检测mRNA与蛋白表达水平；siRNA干扰（三种Viperin特异性siRNA）敲低内源Viperin表达。
- 细胞基病毒RdRp活性检测：基于双顺反子报告系统（含萤火虫荧光素酶Fluc作为内参，海肾荧光素酶RLuc由GAstV-2 RdRp反义转录产生）评估RdRp活性。
- ddhCTP检测：LC–MS定量细胞内ddhCTP浓度。
- 动物实验：30只1日龄未接种疫苗的雏鹅，随机分为对照组、GAstV-2组和ddhCTP（5 mg/d）组，每组10只；4日龄时除对照组外均口服攻毒GAstV-2（0.5 mL，0.5×10^4.25 TCID₅₀/只），随后连续5天肌肉注射ddhCTP或PBS；7 dpi时采集肾脏、肝脏、脾脏进行组织病理学、病毒载量及免疫组化分析。

**研究结果**
- **GAstV-2感染在体外和体内诱导Viperin强表达**：在LMH细胞和GRTE细胞中，GAstV-2感染（MOI=1）后24和48 hpi显著上调IFITM5、OASL、MX、TRIM25和Viperin的mRNA表达，其中Viperin上调最显著；在感染雏鹅的肾脏和肝脏中，Viperin mRNA和蛋白水平均明显升高（P<0.05）。
- **ORF2在激活Viperin表达中起关键作用**：将ORF1a、ORF1b和ORF2分别转染LMH细胞，仅ORF2显著上调Viperin表达（P<0.05）；进一步截短发现，ORF2的P2结构域可有效诱导Viperin表达并抑制病毒复制（P<0.05）。
- **Viperin有效抑制GAstV-2复制**：过表达Viperin的LMH细胞以剂量依赖性方式降低病毒RNA拷贝数和衣壳蛋白（Cap）水平（P<0.05）；siRNA敲低Viperin后，病毒复制显著增强（P<0.05），证实Viperin是宿主限制因子。
- **Viperin在病毒进入后阶段抑制GAstV-2感染**：吸附和内化实验表明，Viperin过表达不影响病毒吸附和进入细胞（P>0.05），提示抑制发生在进入后步骤。
- **Viperin通过降低病毒RdRp活性抑制GAstV-2复制**：利用细胞基双荧光素酶报告系统，Viperin过表达显著降低RdRp活性（RLuc/Fluc比值，P<0.01），外源添加NTPs可剂量依赖性恢复RdRp活性、病毒RNA和Cap蛋白水平（P<0.05）。
- **Viperin通过产生ddhCTP抑制GAstV-2复制**：Viperin过表达后细胞内ddhCTP水平显著升高（P<0.05）；外源ddhCTP剂量依赖性降低RdRp活性、病毒RNA和Cap蛋白（P<0.05）。
- **自由基SAM结构域对Viperin介导的GAstV-2复制限制至关重要**：构建Viperin突变体（ΔN缺失N端、ΔC缺失C端、DCA突变SAM结构域的铁硫簇），DCA突变显著恢复RdRp活性、增加病毒复制并降低ddhCTP水平（P<0.05），而ΔC无显著影响（P>0.05），ΔN部分恢复复制但未影响ddhCTP。
- **ddhCTP抑制病毒复制并减轻GAstV-2诱导的雏鹅病理损伤**：ddhCTP治疗组雏鹅死亡率从30%降至0%，体重增加显著改善（P<0.05），肾脏相对重量减轻，肝、肾、脾的组织病理学损伤（如血管周围炎症、肾小管坏死、脾淋巴细胞耗竭）明显减轻，肾脏病毒载量、Cap蛋白表达和病毒分布均显著降低（P<0.05）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Viperin在GAstV-2感染中显著上调，其SAM结构域通过催化ddhCTP产生抑制病毒RdRp活性，是抗病毒关键机制。N端缺失虽不影响ddhCTP合成，但部分恢复病毒复制，提示N端可能通过锚定内质网和脂滴参与抗病毒功能。ddhCTP作为链终止核苷类似物，对多种RNA病毒有效，本研究首次证实其对GAstV-2的体内外抗病毒作用，为缺乏有效治疗药物的雏鹅痛风病提供了候选策略。研究局限性在于未阐明ORF2 P2结构域诱导Viperin表达的具体机制，已有研究表明Viperin表达受IFN/JAK/STAT、TLR、IRF1/3等多种通路调控，有待进一步研究。
**结论部分翻译**：本研究表明，Viperin在GAstV-2感染期间被强烈上调，并发挥显著抗病毒效应。Viperin的SAM结构域对其活性至关重要，通过介导ddhCTP产生进而抑制病毒RdRp。外源ddhCTP给药在体外和体内均能有效限制GAstV-2复制。这些结果确立了Viperin作为针对GAstV-2的关键宿主防御因子，并确定了控制鹅GAstV-2感染的新潜在策略。