《Journal of Chromatography A》：Automated and Systematic Screening of Ion-Pair Reversed-Phase LC Conditions Accelerating Assay Development of Oligonucleotides in Pharmaceutical Mixtures
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一种新的自动化离子对反相液相色谱（IP-RPLC）条件筛选方法用于寡核苷酸分析。专用洗涤程序实现了离子对试剂之间的可靠切换。该平台在单个工作流程中筛选了离子对试剂、溶剂和固定相的影响。没有通用的IP-RPLC条件适用于所有寡核苷酸杂质。
一种新的自动化离子对反相液相色谱（IP-RPLC）条件筛选方法用于寡核苷酸分析。专用洗涤程序实现了离子对试剂之间的可靠切换。该平台在单个工作流程中筛选了离子对试剂、溶剂和固定相的影响。没有通用的IP-RPLC条件适用于所有寡核苷酸杂质。
**论文解读文章**
**研究背景**
近年来，寡核苷酸（oligonucleotides）作为新型治疗性生物分子发展迅速，通过序列特异性识别调控基因表达，具有高选择性和可编程性。然而，其多步合成过程会产生大量工艺相关杂质，如截短序列、缺失产物、碱基修饰类似物以及硫代磷酸酯（phosphorothioate, PS）立体异构体混合物。这些杂质对生物活性、安全性、可制造性和批次一致性有显著影响，因此需要可靠的分析方法。离子对反相液相色谱（ion-pair reversed-phase liquid chromatography, IP-RPLC）被认为是寡核苷酸分析的金标准技术，通过阳离子离子对试剂（ion-pairing reagent, IPR）与带负电的磷酸骨架结合，增加疏水性实现分离。但方法开发受IPR种类、有机溶剂和固定相化学性质的影响，传统方法耗时且效率低。目前尚无统一的IP-RPLC条件适用于所有寡核苷酸杂质，因此需要自动化筛选策略来加速方法开发。
**研究内容**
研究人员开发了一种自动化IP-RPLC筛选平台，系统评估三种固定相（C18、苯基（phenyl）、C18 shield）和九种流动相（含不同IPR：三乙胺（TEA）、丁胺（BA）、己胺（HA）；有机溶剂：乙腈（MeCN）、甲醇（MeOH）；固定添加六氟异丙醇（HFIP））的组合，采用分离质量因子（Separation Quality Factor, SQF）作为评估指标。平台包括专用洗涤程序以避免IPR残留。研究人员对三种模型样品（短mers和长mers混合物、PO/PS变体混合物、高度修饰的ASO-X样品）进行筛选和梯度优化，最终为每种样品找到最优条件。该研究发表在《Journal of Chromatography A》。
**主要关键技术方法**
1. 自动化筛选平台：配置三个不同固定相（ACQUITY Premier BEH C18、苯基、C18 shield，均为130 ?，2.1×50 mm，1.7 μm）和九种流动相（含TEA、BA、HA三种IPR，MeCN或MeOH为有机溶剂，固定100 mM HFIP，pH 7.5-9.0）。
2. 专用洗涤程序：更换IPR时，使用1:1:1:1的异丙醇、甲醇、乙腈和水（含0.1%五氟丙酸）以0.2 mL/min冲洗45分钟，再以100%乙腈冲洗10分钟，避免残留。
3. 分离质量评估：采用SQF指标（综合归一化动力学效率、平均峰对称性、峰分布均匀性、洗脱窗口利用率和关键峰顺序），介于0-1之间，评估色谱分离质量。
**研究结果**
**3.1 IP-RPLC筛选平台**
研究人员搭建了自动化筛选系统，通过多溶剂选择阀和柱切换阀实现八种流动相和三种固定相的快速切换。所有流动相均与质谱（MS）兼容，HFIP作为酸性抗衡离子，IPR浓度低于25 mM。专用洗涤程序确保IPR切换时无交叉污染。
**3.2 IP-RPLC筛选用于寡核苷酸样品分离（短mers和长mers）**
针对Mixture 1（18-mer至22-mer同一序列寡核苷酸），研究人员测试了所有条件。结果表明，有机溶剂显著影响苯基柱上的峰形和分辨率：MeOH比MeCN提供更高的分辨率和更低的洗脱强度。HA（最疏水IPR）导致保留时间过长和峰展宽，掩盖了短寡核苷酸间的疏水差异。最终选择20 mM BA + MeOH在苯基柱上的条件，SQF为0.46；优化梯度（0-15% B在1分钟，15-18% B在5分钟）后，SQF升至0.62，实现n-2至n+2五种寡核苷酸的基线分离，分析时间<5分钟。
**3.3 IP-RPLC筛选用于PS和PO键合分离**
针对Mixture 2（fomivirsen相关PO/PS变体，21-mer全PS ASO及其变体），研究人员发现MeOH流动相比MeCN提供更好的选择性，因为MeOH洗脱强度低且质子性溶剂增强结构差异识别。TEA和BA在苯基和C18柱上表现最佳，而HA掩蔽了PO/PS的疏水差异。最高SQF条件为TEA + MeOH在苯基柱上（SQF=0.37）；优化梯度（5-13% B在1分钟，保持至17.9分钟，再线性升至15% B至33分钟）后，SQF升至0.56，有效分离四种PO/PS变体，洗脱顺序随PS数量增加而延长。
**3.4 IP-RPLC筛选应用于合成寡核苷酸样品杂质分析**
针对高度修饰的ASO-X（18-mer，含PS修饰、2’MOE糖修饰和甲基嘧啶），研究人员测试了三种纯度水平（20-40%、50-60%、>95%）。筛选发现，HA + MeCN在C18 shield柱上条件获得最高SQF（>0.70）和最丰富的杂质峰分布。优化梯度（0-10% B在1分钟，10-25% B在15分钟）后，高纯度样品显示单一主峰，低纯度样品杂质峰数量和强度显著增加，证明该方法能有效区分不同纯度样品的杂质谱。
**总结讨论**
研究结果表明，没有单一的IP-RPLC条件适用于所有寡核苷酸杂质。对于短mers和长mers，中等疏水IPR（BA）结合MeOH和苯基柱可实现快速分离；对于PO/PS杂质，TEA结合MeOH和苯基柱经梯度优化后能分辨PS含量差异；对于高度修饰的复杂ASO-X，疏水IPR（HA）结合MeCN和C18 shield柱提供最丰富的杂质指纹。该自动化平台为快速开发IP-RPLC方法提供了实用框架，可推广至新型寡核苷酸模态和杂质类型，加速LC-UV和LC-MS质控工作流程。
**结论部分翻译**
本研究引入了一种自动化IP-RPLC筛选策略，用于快速开发针对挑战性寡核苷酸杂质的色谱方法。通过在同一平台中系统组合不同离子对试剂、有机溶剂和固定相化学性质，结合分离质量因子（SQF）作为评估指标，能够快速识别在保留、峰形和选择性之间提供最佳平衡的条件。专用洗涤程序在更换离子对系统时对于可靠筛选至关重要。在三个模型样品集上获得的结果表明，没有单一条件对所有寡核苷酸相关杂质普遍最优。对于短mers和长mers的分析，中等疏水离子对条件结合甲醇和苯基固定相确保了快速基线分离；对于fomivirsen相关的PO/PS杂质，类似的甲醇和苯基固定相组合在梯度优化后分辨出硫代磷酸酯含量的细微差异；对于不同纯度水平的高度修饰复杂ASO-X样品，基于己胺的疏水性离子对系统提供了最丰富的杂质指纹。这些观察证实，在开发治疗性寡核苷酸的IP-RPLC方法时，条件筛选至关重要。总体而言，所提出的方法为加速合成寡核苷酸IP-RPLC方法开发提供了实用且高效的框架。除三个案例研究外，该平台应广泛适用于新型寡核苷酸模态和杂质类型，促进未来LC-UV和LC-MS质控工作流程的发展。
