《Journal of Chromatography B》：Validated UPLC-MS/MS quantification and intracellular PK-PD Modeling of periplocin-related cardiac glycosides in H/R-injured H9c2 cells
编辑推荐：
•采用UPLC-MS/MS方法对H9c2细胞裂解液中的五种强心苷进行了定量分析。•该方法的灵敏度、精确度、回收率及稳定性均表现良好。•心肌缺血再灌注损伤会加速这些分析物的细胞内积累。•细胞内的药代动力学特征与细胞的存活状态存在关联。•特定的药代动力学-药效学参数可反映其持续的细胞
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采用UPLC-MS/MS方法对H9c2细胞裂解液中的五种强心苷进行了定量分析。
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该方法的灵敏度、精确度、回收率及稳定性均表现良好。
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心肌缺血再灌注损伤会加速这些分析物的细胞内积累。
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细胞内的药代动力学特征与细胞的存活状态存在关联。
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特定的药代动力学-药效学参数可反映其持续的细胞保护作用。
引言
心血管疾病，尤其是缺血性心脏病，具有极高的发病率和死亡率，对全球公共卫生构成了严重威胁[1]、[2]。黄精，即黄精的干燥根皮，是一种极具价值的传统中药，在治疗心力衰竭和心血管疾病方面有着悠久的临床应用历史[3]、[4]、[5]。先前的植物化学和药理学研究表明，强心苷是这种中药中重要的生物活性成分，其中黄精甲素是最为常见且最具代表性的活性单体[6]、[7]。越来越多的证据表明，黄精甲素可通过增强心肌收缩力并降低心率来发挥强大的心脏保护作用[8]、[9]。然而，真正导致这些体内作用的物质基础其实更为复杂。像黄精甲素这样的天然产物在进入体内后通常会经历复杂的生物转化过程，生成一系列次级代谢物[10]。如今人们越来越认识到，往往是这些代谢物而非母体化合物本身，才是决定药物整体治疗效果的主要因素[11]、[12]。虽然之前的研究已经确定黄精甲素马林和黄精甲素吉宁是黄精甲素的典型活性代谢物，但我们的初步代谢分析还发现，gomphogenin和17α-asclepioside也是其体内生物转化过程中产生的微量代谢物[13]、[14]。值得注意的是，所有这些代谢标志物都具有保守的心脏兴奋类甾体结构，并且具备显著的生物学活性[15]。不过，这些特定代谢标志物在作用靶点处的确切动力学行为及剂量效应关系仍有待进一步阐明。
传统上，基于全身血浆浓度的药代动力学-药效学（PK-PD）建模方法被广泛用于揭示药物剂量与作用效果之间的动态关系[16]、[17]、[18]。虽然全身暴露情况对于了解一般的药代动力学特性至关重要，但心血管药物的真正药理作用实际上是由它们与心肌细胞表面或内部的特定靶点结合所引发的[19]、[20]。由于细胞膜通透性以及细胞内的分布情况等生理因素会显著影响药物在局部的积累，因此全身血浆浓度并不总能准确反映药物在具体作用位点的实际浓度水平[21]、[22]、[23]。因此，建立一种能够直接监测目标细胞内药物浓度的细胞内PK-PD模型，是一种非常有价值的补充方法。这样的先进整合模型有助于弥合细胞外药物暴露与细胞内治疗反应之间的差距。
尽管已有利用液相色谱-串联质谱技术分析黄精成分及相关代谢物的研究报道，但大多数研究主要集中在全身暴露情况、代谢物鉴定或组织分布等方面[24]、[25]。目前针对受损心肌细胞中黄精甲素相关强心苷的实时细胞内定量分析仍然较少，而这类信息非常重要，因为细胞内的药物暴露情况可能与细胞外或全身的暴露情况不同，更能反映药物在作用位点的实际可用浓度。通过细胞内PK-PD分析，还可以将药物随时间变化的细胞内暴露情况与相应的药效学反应联系起来。为此，本研究采用了经过清洗的H9c2细胞裂解液，用以估算黄精甲素相关强心苷的细胞内暴露程度，并将其与细胞的保护作用联系起来。在本研究中，我们开发并验证了一种UPLC-MS/MS方法，可用于同时定量检测H9c2细胞裂解液中的黄精甲素、黄精甲素马林、黄精甲素吉宁、gomphogenin和17α-asclepioside。随后将该方法应用于正常细胞以及缺氧/复氧损伤的H9c2细胞中，以分析这些物质的细胞内药代动力学特征。其中，缺氧/复氧损伤的H9c2细胞被用作模拟缺血/再灌注损伤的体外模型，用以评估细胞的保护作用，并将其与细胞内的药物暴露程度联系起来。最后，通过将细胞内浓度-时间数据与相应时间点的细胞存活率数据相结合，建立了细胞层面的药代动力学-药效学关系。
章节要点
试剂与化学品
黄精甲素、黄精甲素马林、黄精甲素吉宁以及作为内标物的淫羊藿苷均购自中国成都的成都德思特生物技术有限公司，均为分析级产品，纯度均不低于98%。另外两种代谢标志物gomphogenin和17α-asclepioside则是在我们实验室之前从黄精的体内代谢物中分离并鉴定出来的，其纯度分别为90.23%和94.40%。淫羊藿苷则是
生物分析方法的验证
用于测定H9c2细胞裂解液中五种强心苷标志物的UPLC-MS/MS方法已经得到了成功验证。由于在分析物及其内标物的保留时间处均未观察到显著的内源干扰，因此该方法具有良好的专属性（见图2）。在空白细胞裂解液中，分析物及其内标物的保留时间处也均未出现内源干扰。所有分析物在其对应的浓度范围内都表现出良好的线性关系（r≥0.9990），
结论
本研究开发并验证了一种UPLC-MS/MS方法，可用于同时定量检测H9c2细胞裂解液中的黄精甲素及其四种相关的强心苷代谢物。该方法已被成功应用于正常细胞以及缺氧/复氧损伤细胞中的细胞内药代动力学分析。心肌缺血再灌注损伤会加速多种分析物的细胞内积累，并改变它们的暴露规律。通过将细胞内浓度-时间数据与对应时间点的细胞存活率数据相结合
CRediT作者贡献说明
赵鹏：论文撰写——初稿撰写、软件使用、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。左凡娇：资源提供、方法设计、数据整理。李彩霞：软件使用、正式分析。李彦锦：软件使用、方法设计。吴浩然：方法设计、数据整理。赵颖晶：方法设计。朱亚萌：正式分析、概念构思。何军：论文撰写——审阅与编辑、资源提供、概念构思。
资金支持声明
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（项目编号：82274091）。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
Peng Zhao|Fanjiao Zuo|Caixia Li|Yanjin Li|Haoran Wu|Yingjing Zhao|Yameng Zhu|Jun He
