ENKRVM→SRD投射构成一个功能特异性双向疼痛调节回路

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：The ENKRVM→SRD Projection Constitutes a Functionally Specific Circuit for Bidirectional Pain Modulation

　　

目的：慢性疼痛管理因缺乏有效且副作用小的疗法而面临重大临床挑战。延髓头端腹内侧核（rostral ventromedial medulla, RVM）是疼痛调节的关键脑干中枢，但其神经元亚群的神经化学特性和功能作用尚未完全阐明。方法：研究人员通过构建完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant, CFA）诱导的炎性疼痛模型和慢性缩窄性损伤（chronic constrictive injury, CCI）神经病理性疼痛模型，结合行为学实验、原位杂交、化学遗传学、光遗传学和体内电生理技术进行了一系列测试。结果：本研究鉴定出RVM中的脑啡肽能神经元及其向背侧网状亚核（subnucleus reticularis dorsalis, SRD）的投射构成一个独特的下行疼痛抑制回路。RNAscope显示，在炎性和神经病理性疼痛小鼠模型中，ENK^RVM神经元活动增强。双向化学遗传学和光遗传学操作表明，抑制ENK^RVM神经元或其向SRD的投射可诱导痛觉超敏，而激活则可提高基础痛阈并逆转CFA和CCI模型中的痛觉超敏。该通路选择性调节伤害感受，不影响焦虑或运动功能。结论：这些发现将ENK^RVM→SRD通路鉴定为一个双向疼痛抑制的下行回路，突显其作为镇痛干预治疗靶点的潜力。

**研究背景与问题**
慢性疼痛（包括炎性和神经病理性疼痛）是全球性的健康负担，现有一线疗法（尤其是阿片类药物）常因疗效有限、耐受性和严重副作用（如成瘾和呼吸抑制）而受限。因此，阐明内源性疼痛调节机制以寻找更精准有效的治疗靶点至关重要。疼痛感知并非被动反映外周伤害性输入，而是由从脑到脊髓的下行调节通路主动塑造。延髓头端腹内侧核（rostral ventromedial medulla, RVM）作为下行调节系统的核心中继和整合枢纽，其功能框架由Fields等基于电生理研究建立，定义了促进伤害感受的ON细胞、抑制伤害感受传递的OFF细胞及功能不明的NEUTRAL细胞。然而，这些功能定义神经元群体的神经化学身份，以及不同神经化学亚群如何参与不同疼痛状态，仍是长期未解的问题。脑啡肽（enkephalin, ENK）作为一种内源性阿片肽，在RVM中大量表达，主要作用于δ-阿片受体（delta-opioid receptor, DOR）和μ-阿片受体（mu-opioid receptor, MOR）发挥抑制作用。早期药理学研究表明RVM内ENK信号参与镇痛，但因RVM的解剖和神经化学复杂性，ENK^RVM神经元作为独立群体的具体贡献——包括其活动是否维持基础痛阈、是否在慢性疼痛中被激活以对抗超敏——仍不清楚。先前研究已鉴定出主要由GABA能/脑啡肽能神经元组成的RVM-脊髓背角下行通路，提示ENK^RVM神经元并非均一群体，可能包含靶向不同下游区域（如脊髓背角和脑干网状核）的解剖和功能各异亚群。RVM与背侧网状亚核（subnucleus reticularis dorsalis, SRD）存在相互连接，形成可能对伤害感受精细调节至关重要的反馈环路。尽管RVM–SRD通路的解剖存在已明确，但特定神经化学投射——尤其是从RVM到SRD的脑啡肽能投射（ENK^RVM→SRD）——的功能作用仍大部分未知。解析该通路可能揭示疼痛调节能否与情感和动机等神经功能分离。为此，研究人员开展了本研究。

**主要关键技术方法**
研究人员采用多学科方法：使用C57BL/6J小鼠（来自北京维通利华）和Penk-ires-cre小鼠（来自上海南方模式生物）构建CFA诱导的炎性疼痛模型和CCI诱导的神经病理性疼痛模型；应用RNAscope原位杂交检测c-Fos与ENK mRNA共定位；通过化学遗传学（DREADD系统，运用hM4Di和hM3Dq）和光遗传学（ChR2和eNpHR3.0）双向操控ENK^RVM神经元及其向SRD的投射；结合体内电生理记录SRD神经元活动；行为学测试包括von Frey丝、热板实验、旷场实验（open field test, OFT）、条件性位置偏好/厌恶（conditioned place preference/aversion, CPP/CPA）和实时位置偏好/厌恶（real-time place preference/aversion, RTPP/RTPA）。

**研究结果**
**3.1 ENK^RVM神经元在疼痛超敏状态下显著激活**
通过RNAscope原位杂交，研究人员发现CFA和CCI模型小鼠RVM中c-Fos阳性细胞数量显著增加，且c-Fos与ENK共标记的神经元数量亦显著增多，表明炎性和神经病理性疼痛条件下ENK^RVM神经元活动增强。

**3.2 抑制ENK^RVM神经元诱导机械和热痛觉超敏及厌恶行为**
向Penk-ires-cre小鼠RVM注射AAV-DIO-hM4Di-mCherry，化学遗传学抑制ENK^RVM神经元显著降低机械和热痛阈。条件性位置厌恶（CPA）测试显示，抑制后小鼠在CNO配对箱中停留时间减少，提示厌恶效应。光遗传学抑制（eNpHR3.0）同样快速可逆地降低痛阈，并引起实时位置厌恶（RTPA）。旷场实验表明抑制不影响运动功能或焦虑样行为。

**3.3 激活ENK^RVM神经元升高基础痛阈**
向Penk-ires-cre小鼠RVM注射AAV-DIO-ChR2-mCherry，光遗传学激活ENK^RVM神经元显著升高机械和热痛阈，且刺激停止后恢复。实时位置偏好（RTPP）测试显示激活未产生位置偏好，旷场实验无运动或焦虑改变。化学遗传学激活（hM3Dq）结果一致，确认ENK^RVM激活选择性升高基础痛阈。

**3.4 激活ENK^RVM神经元缓解炎性和神经病理性疼痛超敏**
在CFA和CCI模型中，光遗传学激活ENK^RVM神经元显著升高机械和热痛阈，且RTPP测试显示刺激侧停留时间增加，表明疼痛缓解相关奖励。化学遗传学激活同样升高痛阈，效应约2.5小时后恢复基线。

**3.5 ENK^RVM→SRD投射的特征揭示双向调节基础痛阈**
顺行示踪显示RVM中ENK^RVM神经元轴突密集投射至SRD；逆行示踪确认SRD注射后RVM中标记细胞体，且SRD投射的ENK^RVM神经元占RVM中ENK阳性神经元总数的35.06%。体内光遗传学-电生理记录显示，激活RVM中ENK^RVM轴突末梢显著抑制SRD神经元放电频率，表明功能性抑制性投射。光遗传学抑制ENK^RVM→SRD投射（在SRD照射）降低机械和热痛阈，并引起实时位置厌恶。交叉化学遗传学策略（AAV-FDIO-hM3Dq注入RVM、AAV-retro-FLEx-FlpO注入SRD）选择性激活该投射，升高基础痛阈。旷场实验显示该通路操控不影响运动或焦虑样行为。脊髓切片未检测到标记，表明该策略优先标记ENK^RVM→SRD通路而非脊髓投射。

**3.6 激活ENK^RVM→SRD投射缓解炎性和神经病理性疼痛超敏**
在CFA和CCI模型中，交叉化学遗传学激活ENK^RVM→SRD通路显著升高机械和热痛阈，效应约2.5小时后恢复。CPP测试显示，疼痛小鼠在CNO配对箱中停留时间增加，CPP评分升高，表明激活该通路产生疼痛缓解相关奖励。

**总结讨论与结论**
本研究首次综合证明ENK^RVM神经元及其ENK^RVM→SRD投射构成功能选择性的下行疼痛抑制微回路。该回路对门控基础伤害感受以及逆转炎性和神经病理性超敏既是必要的也是充分的。在基础状态下，抑制该回路诱导痛觉超敏，激活则升高痛阈；在慢性疼痛模型中，激活可快速可逆地缓解已建立的超敏。重要的是，这些抗伤害效应不伴随运动功能或焦虑样行为的改变，表明ENK^RVM→SRD通路是相对选择性的疼痛调节回路。研究还发现ENK^RVM操控的动机结果依赖于疼痛状态：在无痛小鼠中激活不产生奖赏，而在疼痛小鼠中激活则产生疼痛缓解相关奖赏；抑制则引起厌恶。该回路的时间可控性（化学遗传学约30分钟起效，2.5小时消退；光遗传学毫秒级精度）为闭环神经调控策略提供了基础。鉴于脑啡肽能神经元在啮齿类和人类RVM中的高度进化保守性，ENK^RVM→SRD回路可能成为治疗神经病理性疼痛和炎性疼痛的转化靶点。研究结论：总之，这些发现将ENK^RVM神经元及其ENK^RVM→SRD投射鉴定为下行疼痛抑制系统中的关键节点。该微回路双向调节伤害感受，而不涉及情感或运动成分，从而为理解脑干疼痛控制提供了精细的功能框架，并为开发具有最小副作用的精准镇痛策略奠定了理论和实验基础。