TRIM37与TRIM28相互作用以维持迁移过程中原始生殖细胞的身份

《Cell Research》：TRIM37 interacts with TRIM28 to maintain primordial germ cell identity during migration

　　

在原始生殖细胞（PGC）特化过程中，体细胞程序的抑制对于生殖系身份的建立至关重要。然而，之后保护PGC命运的机制仍然未知。在此，研究人员鉴定出E3泛素连接酶TRIM37是迁移过程中PGC命运的关键保护因子。Trim37缺失导致从胚胎第9.5天（E9.5）开始出现严重PGC缺陷，到E12.5时PGC完全耗竭，并导致向体细胞状态的异常转变。机制上，TRIM37通过其MATH结构域结合TRIM28，并通过其RING结构域泛素化TRIM28，增强TRIM37–TRIM28相互作用并促进TRIM37的核滞留。强制TRIM37核输出导致PGC丢失。此外，破坏TRIM37连接酶活性或突变TRIM28泛素化位点会损害PGC维持。研究人员进一步表明，TRIM37–TRIM28复合物可能协同AP2γ，限制体细胞基因位点的染色质可及性和H3K27ac水平，从而在PGC中抑制体细胞转录程序。总之，研究人员的发现揭示了一个TRIM37–TRIM28–AP2γ调控复合物，该复合物通过在PGC迁移过程中阻止体细胞转录程序的激活来保护生殖细胞命运。

在原始生殖细胞（PGC）特化过程中，抑制体细胞程序对于建立生殖系身份至关重要，但迁移过程中如何维持PGC身份仍不清楚。已知TRIM37突变导致人类Mulibrey nanism（一种伴有不育的罕见常染色体隐性遗传病），但其在生殖细胞发育中的作用未明。研究人员通过改进的半克隆技术结合CRISPR-Cas9碱基编辑器进行体内遗传筛选，鉴定出Trim37是PGC迁移过程中的关键保护因子。该研究利用多种小鼠模型（包括全敲除、条件敲除、点突变以及人源突变模拟品），结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、ATAC-seq、CUT&Tag、CUT&RUN、免疫沉淀-质谱（IP-MS）、体外泛素化等方法，系统揭示了TRIM37与TRIM28相互作用并通过泛素化调控PGC命运的分子机制。论文发表在《Cell Research》。

**结果**

**“在小鼠中进行的遗传筛选鉴定出Trim37对PGC发育至关重要”**
研究人员利用CAG-C9-3 AG-haESCs（携带Oct4-EGFP转基因）结合sgRNA库进行体内筛选，针对TRIM家族基因（33个在PGC中表达的成员）设计sgRNA。通过半克隆技术产生E12.5胚胎，发现两个独立携带Trim37双等位基因突变的胚胎出现严重PGC缺失，确认Trim37为候选基因。进一步构建Trim37敲除（Trim37^ko1和Trim37^ko2）小鼠模型，验证了E12.5性腺中PGC完全缺失。

**“TRIM37以主要PGC内在的方式保护PGC发育”**
通过体外PGC样细胞（PGCLC）分化实验，发现Trim37缺失不影响第4天PGCLC数量，但显著减少第6天数量，表明Trim37对PGC发育而非特化关键。利用Blimp1-T2A-Cre和Trim37^flox小鼠生成PGC特异性敲除（Trim37^cko），E12.5性腺中无PGC，证实Trim37在PGC中以细胞自主方式发挥作用。

**“Trim37参与PGC迁移”**
表型分析表明，Trim37^ko1和Trim37^ko2成年小鼠性腺萎缩无生殖细胞，但体型正常，未重现Mulibrey nanism的生长障碍。构建FINmajor突变小鼠模型（模拟人类MUL患者突变），同样出现PGC缺失，提示TRIM37在生殖细胞发育中的功能保守。时间点分析显示，E8.5时PGC数量正常，E9.5时减少70%，E11.5时降至10%以下，证明Trim37在PGC迁移起始阶段发挥作用。

**“Trim37通过抑制体细胞转变维持PGC命运”**
cleaved caspase-3染色和TUNEL检测未发现凋亡信号。scRNA-seq显示，E9.5时约20%的Trim37缺陷PGC（非典型PGC）与体细胞聚类，表达体细胞发育基因，偏离正常PGC发育轨迹。谱系示踪实验（Blimp1-T2A-Cre; mTmG）表明，E9.5时GFP阳性细胞中仅有约32%表达OCT4（PGC标志物），而对照组约93.3%，证实Trim37缺失导致PGC向体细胞身份转变。

**“TRIM37与TRIM28相互作用维持PGC命运”**
通过IP-MS从Trim37^3×Flag性腺中鉴定出39种候选相互作用蛋白，其中TRIM28排名第二。Co-IP和GST pull-down实验证实两者直接结合，且MATH结构域介导此相互作用。MATH结构域缺失或G322V突变（对应MUL患者突变）破坏TRIM37–TRIM28结合，导致PGC完全缺失。条件性敲除Trim28（Trim28^cko）导致E9.5后PGC数量减少，表型与Trim37缺失相似。

**“TRIM28介导的TRIM37核滞留对PGC发育至关重要”**
细胞定位实验显示，TRIM28共表达促进TRIM37核积累。G322V突变或TRIM28核输入突变（R487E+V488E）降低TRIM37核定位。用核输出信号（NES）替换TRIM37的核定位序列（NLS）强制其出核，导致PGC几乎完全消失，而NLS缺失仅部分影响，表明TRIM28介导的TRIM37核滞留是PGC发育所必需的。

**“TRIM37对TRIM28的泛素化保护PGC发育”**
体外泛素化实验和E. coli泛素化系统表明，TRIM37通过其RING结构域（关键残基C18）对TRIM28进行单泛素化和多泛素化。RING结构域缺失或C18R突变损害PGC发育。质谱鉴定TRIM28的K774和K779为泛素化位点，双突变（K774R+K779R）降低泛素化并削弱TRIM37–TRIM28相互作用。在体内，条件性引入TRIM28^K774R+K779R突变部分模拟Trim37缺失表型，E12.5时PGC数量减少。

**“TRIM37和TRIM28与AP2γ协同重塑染色质并抑制体细胞基因程序”**
E9.25 PGC的RNA-seq和ATAC-seq分析显示，Trim37缺失导致染色质可及性广泛增加，尤其体细胞发育基因区域。CUT&Tag分析表明，H3K27ac水平升高，而H3K9me3变化不显著。TRIM28 CUT&RUN显示，95.8%的差异结合峰下调，这些峰与发育基因相关。基序分析发现AP2γ结合位点在下调TRIM28峰中富集。Co-IP证实TRIM37与AP2γ相互作用。AP2γ CUT&RUN显示，其结合位点与下调TRIM28峰部分重叠（4089/12381）。条件性敲除Ap2γ（Blimp1-Cre）导致E9.5后PGC严重减少，表明AP2γ在迁移中维持PGC命运。

**讨论与结论**
研究表明，迁移中的PGC依赖于TRIM37–TRIM28–AP2γ阻遏复合物主动抑制体细胞命运，而非仅通过增殖与凋亡平衡维持。TRIM37缺失导致PGC退出生殖系程序并进入异常体细胞样状态，但并非真正的转分化。机制上，TRIM37泛素化TRIM28以增强其相互作用并促进TRIM37核积累，进而限制体细胞基因位点的染色质可及性和H3K27ac水平。AP2γ可能参与招募该复合物至部分靶点。MUL患者相关突变（FINmajor和G322V）在小鼠中重现不育表型，且人PGC中AP2γ和TRIM28与TRIM37共表达，提示该机制在人类中保守。总之，该研究揭示了保护特化PGC免受体细胞分化的综合机制，为生殖细胞生物学和生殖健康提供了新见解。