人类肾脏发育的单细胞空间图谱揭示微环境引导细胞命运决定

《Nature Genetics》：Single-cell spatial mapping of human kidney development implicates the microenvironment in guiding cell fate decisions

　　

进化利用细胞-细胞通讯作为协调器官发育的策略，从而实现复杂结构的可重复生成。经典研究通常在模式生物中逐一研究这些相互作用，限制了研究人员对细胞间协调如何指导人类发育的理解。研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（spatial transcriptomics）研究人类肾脏发育，分析了超过700,000个细胞。通过空间上绘制基因表达和分化轨迹，研究人员定义了肾脏发育的空间组织。分析揭示了未被认识的细胞可塑性（plasticity），表明早期模式建立过程中确定的细胞命运可以在后期被修正。这种可塑性为细胞命运如何在复杂模式组织中稳健建立提供了潜在机制。此外，通过全基因组、空间感知的细胞-细胞相互作用分析，研究人员将局部配体信号与细胞命运决定联系起来。研究人员还基于聚集的细胞外信号定义了具有生物学意义的细胞邻域（cellular neighborhoods），为大规模理解人类发育的协调提供了蓝图。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
肾脏是空间结构复杂的器官，包含超过30种特化细胞类型，其功能单位是肾单位。健康个体出生时肾单位数量在200,000至2,000,000之间，低肾单位 endowment与高血压和慢性肾脏病风险增加相关。肾脏发育异常会导致先天性肾脏和尿路畸形，是儿童慢性肾脏病的主要原因。然而，人类肾脏发育研究存在技术局限性。肾单位形成具有空间编排性：近端肾单位（包括肾小体和大部分肾小管）由肾单位祖细胞（nephron progenitor cells, NPCs）形成，而输尿管芽（ureteric bud, UB）则生成连接小管和集合系统部分。小鼠研究已鉴定出对肾脏发育至关重要的细胞-细胞和配体-受体相互作用，但人类肾脏发育中这些机制尚不明确。尽管发育通路在物种间保守，但关键生物学差异已被注意到。先前单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究利用伪时间（pseudotime）分析人类肾脏发育，但存在不确定性：小鼠研究表明NPC来源的中间体分别形成肾小体和肾小管，而人类研究则提示中间体采取近端与远端命运，近端细胞产生足细胞和近端小管（PT）细胞。这些矛盾促使研究人员开展本研究，通过整合经典组织学、单细胞转录组学和空间转录组学，绘制人类肾脏发育的分子图谱，并探究微环境如何引导细胞命运决定。

**研究内容与结论**
研究人员对5个人类胎儿肾脏（孕龄12.5-20.5周）进行scRNA-seq，构建包含65,289个单细胞的图谱，涵盖肾单位、UB、基质、内皮和免疫细胞五大谱系。通过CellRank分析分化轨迹，发现NPC首先分化为早期中间体，然后采取肾小体前体（prerenal corpuscle）或肾小管前体（pretubular）命运，这与小鼠研究一致。值得注意的是，研究人员发现细胞可塑性：部分具有PT转录状态的细胞可转化为壁层上皮细胞（parietal epithelial cells, PECs）。通过空间转录组学（CosMx和Xenium平台）验证，在胎儿肾脏中观察到表达PT标记的PECs，而儿童肾脏中无此现象，提示胎儿特异性状态转换。小鼠克隆谱系示踪（Pax2rtTA;TetO.Cre/R26.Confetti模型）证实单个肾单位祖细胞的后代可同时贡献于肾小体和肾小管命运，挑战了现有模型。研究人员进一步通过空间感知的配体-受体分析（CytoSignal）鉴定与细胞命运相关的信号，发现胰岛素样生长因子2（IGF2）与NPC自我更新高度相关，并通过小鼠肾外植体和人类肾类器官实验验证了IGF2促进UB分支和NPC扩增，而IGF1R抑制剂linsitinib则抑制这些过程。此外，研究人员基于配体信号定义了无偏的微环境邻域，这些邻域与经典组织学结构对应，并能预测细胞命运。该研究发表在《Nature Genetics》。

**主要技术方法**
研究人员利用以下关键技术：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）对5个胎儿肾脏样本进行转录组分析；2）空间转录组学（CosMx和Xenium平台）对3个胎儿肾脏和1个儿童肾脏进行空间基因表达定位；3）CellRank算法进行概率性分化轨迹推断；4）CytoSignal进行空间感知的配体-受体相互作用分析；5）小鼠克隆谱系示踪（Pax2rtTA;TetO.Cre/R26.Confetti模型）验证人类发现；6）人类肾类器官和小鼠肾外植体功能实验验证IGF2作用。样本队列来源包括宾夕法尼亚大学和Sheba医疗中心的胎儿肾脏，以及费城儿童医院的儿童肾脏组织。

**研究结果**
**1. 发育中人类肾脏的scRNA图谱**
通过整合五个胎儿肾脏样本，鉴定出肾单位、UB、基质、内皮和免疫细胞五大谱系，并细分NPC、足细胞、PEC、PT、髓袢（LOH）细胞、远曲小管（DCT）及中间体。发现NPC年龄相关基因表达变化，骨形态发生蛋白（BMP）/WNT通路活性随孕龄增加，与分化相关；PT细胞中溶质转运和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路随孕龄上调。

**2. 胎儿肾脏细胞分化轨迹**
利用CellRank计算NPC系分化概率，发现NPC首先转变为早期中间体，然后采取肾小管前体（PT、LOH、DCT）或肾小体前体（足细胞、PEC）命运。通过随机游走分析，发现PT细胞可定向转换为PEC，RNA速度支持这一方向，免疫荧光显示ACE2⁺的PEC存在，空间转录组学证实胎儿肾脏中肾小体内广泛表达PT标记，而儿童肾脏中无此现象。小鼠克隆示踪显示单个克隆可包含PT、PEC和足细胞，证实共同前体起源。

**3. 发育中人类肾脏的空间分子表征**
整合CosMx和scRNA-seq数据，在空间上定位细胞类型和基因表达，确认NPC位于最表层，分化细胞位于深层。伪时间分析显示肾小体命运决定发生在表层，与轨迹分析一致。

**4. 组织学邻域的分子表征**
由病理学家注释组织学结构（如胚基、原始上皮结构、早期肾小体），发现胚基具有最早伪时间且无特定命运富集，原始上皮结构伪时间稍晚但仍无命运富集，早期肾小体则富集足细胞系。同一细胞类型在不同结构中的基因表达差异显著，如中间肾单位细胞在胚基中高表达SIX1/SIX2，在分化结构中表达分化标记。基质细胞亚群（如祖细胞、中间细胞、成纤维细胞、周细胞等）在空间上分布不同。

**5. 空间解析的无偏细胞-细胞相互作用**
使用CellPhoneDB和CytoSignal进行空间感知的配体-受体分析，鉴定出246个保守相互作用。通过计算配体信号与分化轨迹的关联，发现IGF2、GDNF、RSPO3与NPC自我更新高度相关。实验验证：小鼠肾外植体添加IGF2增加UB分支和SIX2⁺帽区面积，IGF1R抑制剂linsitinib减少SIX2⁺细胞；人类肾类器官中linsitinib抑制SIX2和JAG1表达，而IGF2增加两者。此外，鉴定出精氨酸加压素（AVP）与PT轨迹相关，FGF9、KNG1与LOH相关，EFNA4、BMP3与DCT相关，VEGFA、EFNB1与足细胞相关。

**6. 无偏空间邻域为基础的微环境**
基于配体信号矩阵构建UMAP，鉴定出与经典组织学结构对应的邻域，如GDNF邻域对应胚基/NPC，VEGFA邻域对应肾小球，AVP邻域对应集合管。这些邻域能预测细胞命运和自我更新概率。

**讨论与结论**
研究人员通过整合空间分辨的单细胞基因表达、高质量scRNA-seq和概率计算分析，全面解析了人类胎儿肾脏发育。主要概念性进展包括：1）采用微环境感知的方法原位研究细胞命运决定；2）发现晚期细胞命运微调，可修正早期模式建立时的命运决定。研究将细胞命运转变与周围信号环境明确联系起来，通过空间转录组学与轨迹推断整合，生成了全基因组配体相互作用图谱，并基于聚集的细胞外信号而非细胞类型组成定义细胞邻域。该研究鉴定并验证了IGF2作为局部作用因子促进NPC自我更新和早期肾单位分化。研究局限包括空间转录组平台的技术限制（如转录组推断、探针灵敏度等），以及无法直接进行人类胎儿组织谱系示踪。但空间转录组学、概率轨迹推断、正交分子标记和跨物种验证的综合应用代表了当前原位推断人类发育状态转换的金标准。

**研究结论翻译**
总之，本研究提供了一个空间分辨的单细胞框架，用于理解人类肾脏发育。研究人员引入了两个广泛的概念性进展：首先，采用微环境感知的方法原位研究细胞命运决定；其次，鉴定了晚期细胞命运微调，可修正早期模式建立过程中确定的命运决定。这些发现为解析空间环境如何塑造人类发育奠定了基础。