光激活的破伤风神经毒素用于条件性蛋白水解和体内可诱导的突触抑制

《Nature Methods》：Light-activated tetanus neurotoxin for conditional proteolysis and inducible synaptic inhibition in vivo

　　

破伤风神经毒素（tetanus neurotoxin，TeNT）的轻链是一种金属蛋白酶，通过切割内源性囊泡融合蛋白VAMP2来强效抑制突触传递，但其组成型活性阻碍了时空精度。为解决这一问题，研究人员通过将光敏感的LOV结构域插入变构位点，并利用定向进化（directed evolution）优化动态范围，设计了光激活的TeNT（light-activated TeNT，LATeNT）。LATeNT的活性在黑暗中无法检测，但该蛋白酶在弱蓝光照射10–20分钟后开启，从而在体内强效抑制突触。这里研究人员展示了LATeNT能在多个脑区及长距离轴突投射中发挥作用，其效果在24小时内可逆。LATeNT使研究人员能够发现一个调节焦虑样行为的海马中间神经元群体，并证明突触后内源性大麻素（endocannabinoid）胞吐作用对于体内去极化诱导的抑制抑制（depolarization-induced suppression of inhibition，DSI）的重要性。在神经科学之外，LATeNT调节了胰腺β细胞的内源性胰岛素分泌，并将药物暴露、升高的Ca²⁺或受体激活转化为HEK293T细胞中的转基因表达或报告基因分泌。凭借大的动态范围、高光敏感性和持续效果，LATeNT在多种生物系统中实现了通用的、时空分辨的蛋白水解。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
神经递质释放依赖于SNARE复合体，其中VAMP2与SNAP25等蛋白介导突触囊泡融合。破伤风神经毒素（TeNT）的轻链是一种金属蛋白酶，可通过特异性切割VAMP2强效抑制突触传递，但其组成型活性导致无法实现时空精确控制。现有工具如光激活肉毒毒素（PA-BoNT）动态范围小，且双组分系统变异性高。因此，开发一种单链、光控、可逆的TeNT工具，对于精确解析神经环路功能及减少毒性具有重要意义。

**研究内容与意义**
研究人员通过结构引导的蛋白质工程和定向进化，构建了单链光激活TeNT（LATeNT）。LATeNT在黑暗中无活性，经10–20分钟弱蓝光照射后激活，可强效抑制体内突触传递，效果在24小时内可逆。该工具成功应用于发现海马SST⁺中间神经元调控焦虑样行为，并证明突触后内源性大麻素（eCB）胞吐是去极化诱导抑制抑制（DSI）的关键步骤。此外，LATeNT还调控了胰腺β细胞胰岛素分泌，并在HEK293T细胞中构建了响应Ca²⁺、药物或受体激活的合成回路。该研究发表在《Nature Methods》，为神经科学和合成生物学提供了高时空分辨率的蛋白水解工具。

**关键技术与方法**
1. **结构引导的蛋白质工程**：基于TeNT晶体结构（2.3 ?），将工程化光敏感LOV结构域（hLOV）插入TeNT表面暴露环的变构位点（第357–358位氨基酸之间），通过调控LOV结构域的C端Jα螺旋实现光控“夹紧”与释放。
2. **定向进化**：在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建LATeNT突变库，通过荧光激活细胞分选（FACS）进行正/负筛选（3轮正选、2轮负选），最终获得克隆C16（含TeNT K34R和LOV D397N突变），使光/暗活性比从6.7提升至97.3。
3. **生物发光共振能量转移（BRET）**：将LATeNT与萤光素酶NanoLuc融合，利用底物氟呋喃嗪（FFz）或细胞渗透性类似物CFz产生460 nm蓝光，实现药物控制的VAMP2切割（无需外源光源）。
4. **合成生物学回路构建**：通过融合CaBLAM（Ca²⁺依赖萤光素酶）或GPCR- arrestin系统，使LATeNT响应Ca²⁺或G蛋白偶联受体（GPCR）激活；利用RELEASE系统实现光控蛋白分泌。
**样本队列来源**：HEK293T细胞、大鼠原代皮层/海马神经元、MIN6胰腺β细胞、C57BL/6J小鼠、Sst-IRES-FlpO小鼠、Sncg-IRES2-FlpO小鼠。

**研究结果**

**1. LATeNT的设计与定向进化**
通过插入hLOV至TeNT的第357/358位点，获得的LATeNT0在光照下VAMP2切割增加约1.5倍；优化连接子长度（C端截短1个氨基酸）得到LATeNT1，光/暗比达6.7。定向进化5轮后，克隆C16（K34R和D397N突变）在HEK293T细胞中暗活性显著降低，光/暗比达97.3，命名为LATeNT。

**2. LATeNT在HEK293T细胞和培养神经元中的表征**
体外切割实验表明，LATeNT在光照下保留野生型TeNT约36%的活性。点突变（E233A、C415A、I504E）验证了其机制。光关闭后LATeNT活性在几分钟内终止，而慢复位突变体LATeNT*（V381L）活性持续超过60分钟。在培养大鼠神经元中，30分钟光照导致内源性VAMP2减少78%±3%，16–24小时后完全恢复。

**3. LATeNT抑制脑片和体内突触传递**
在培养海马神经元中，LATeNT光照显著降低微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率和幅度。小鼠海马CA3注射AAV后，急性脑片光照导致CA3-CA1突触的AMPAR和NMDAR介导的eEPSC幅度显著下降，配对脉冲比（PPR）增加（提示释放概率降低）。连续光照下，eEPSC在5分钟内开始下降，20分钟达到最大。抑制持续约8小时，24小时完全恢复。LATeNT在低光强（0.03 mW cm^?2）下即可激活，且能抑制长距离投射（腹侧海马至内侧前额叶皮质）。空间特异性实验表明，仅对侧CA1光照导致该区域而非同侧CA1的cleaved VAMP2增加。

**4. LATeNT介导的突触抑制可改变小鼠行为**
在富集环境（EE）实验中，LATeNT抑制CA1到背侧下托（dSub）的投射，消除了EE诱导的c-Fos表达增加。在焦虑样行为实验中，通过在SST⁺中间神经元中表达LATeNT，光照后小鼠在 elevated plus maze（EPM）中开放臂停留时间显著减少（提示焦虑增加），该效应在1周后逆转。光/暗箱实验、蔗糖偏好实验进一步证实焦虑表型，而旷场实验显示运动能力未受影响。与eNpHR3.0对比，LATeNT的持续抑制效应是产生焦虑表型的关键。

**5. NanoLuc–LATeNT用于体内药物激活的VAMP2切割**
将LATeNT与NanoLuc融合，在HEK293T细胞中，底物FFz处理60分钟可达到与光照30分钟相似的VAMP2切割效果。腹腔注射CFz后，小鼠海马中检测到cleaved VAMP2，效果与光纤光照相当。

**6. 控制其他VAMP2依赖通路：内源性大麻素信号与胰岛素分泌**
- **突触后GluA1运输**：在培养海马神经元中，LATeNT光照30分钟显著减少表面GluA1 puncta，而树突棘密度不变。
- **DSI机制**：在Sncg-FlpO小鼠海马CA1中，LATeNT在锥体细胞中表达，ChRmine在CCK篮状细胞中表达。光照20–45分钟后，DSI（去极化诱导的抑制抑制）显著减弱，而对照红光无影响，证实突触后eCB释放依赖SNARE蛋白。
- **胰岛素分泌**：在MIN6胰腺β细胞中，LATeNT表达+光照30分钟显著抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS），并伴随内源性VAMP2切割。

**7. LATeNT的合成生物学应用**
- **Ca²⁺响应**：融合CaBLAM后，Ca²⁺和FFz处理使VAMP2切割增加8.2倍。
- **GPCR响应**：融合arrestin后，CCR6或KORD激活导致VAMP2切割增加5.5倍。
- **光控基因表达**：Gal4-VAMP2-LATeNT*融合蛋白在光照后释放Gal4，驱动UAS-mCherry表达。
- **光控蛋白分泌**：RELEASE系统在LATeNT激活后，SEAP分泌增加4.6倍。
- **通用性验证**：将hLOV插入肉毒毒素A型（BoNT/A）蛋白酶类似位置，获得LABoNT/A，可光控切割SNAP25。

**讨论与结论**
LATeNT通过变构调控实现最小暗活性和近野生型光活性，优于双组分光激活BoNT。与现有工具（如DREADDs、PdCO）相比，LATeNT提供更持久的突触抑制且作用机制更特异（仅切割VAMP2）。未来方向包括：改造LATeNT切割其他底物、应用于胰高血糖素分泌控制、以及开发细胞接触依赖的调控。

**研究结论翻译**：LATeNT提供了一个通过工程化变构调控酶活性的范例，具有出色的动态范围、高光敏感性和持续效果。它能够在多种生物系统中实现通用、时空分辨的蛋白水解，并在神经科学（如发现调控焦虑的中间神经元群体、阐明DSI机制）和合成生物学（如构建响应Ca²⁺、药物或受体的回路）中展现出广泛的应用潜力。