蛋白质硫醇修饰改变驱动衰老大脑中病理性液-液相分离

《Nature Structural & Molecular Biology》：Protein thiol alterations drive pathologic liquid–liquid phase separation in the aging brain

　　

细胞稳态依赖于包括蛋白质翻译后修饰（PTM）与生物分子凝聚体形成等过程的调控。衰老破坏这些过程的平衡，增加疾病易感性与死亡率。研究人员采用化学蛋白质组学技术绘制了小鼠大脑半胱氨酸PTM图谱，发现年龄相关的硫醇氧化增强促进生物分子凝聚体形成；相反，由硫化氢（H2S）产生所调控的蛋白质过硫化（PSSH）抑制生物分子凝聚，维持蛋白质功能。年龄诱导的半胱氨酸PTM改变影响了synapsin 1与G3BP2的相分离特性，导致神经递质释放受损及应激颗粒形成与解聚缺陷，这些特征与衰老及神经退行性疾病相关。缺乏胱硫醚γ-裂解酶（CSE，负责H2S产生的酶）的小鼠寿命缩短，并随年龄自发产生蛋白质聚集体。研究结果凸显了蛋白质PSSH在逆转失调的生物分子凝聚中的治疗潜力，并提示硫化物供体可用于缓解年龄相关疾病。

研究背景与立项依据

衰老被定义为生理适应性逐步下降，伴随随机与确定性有害变化的累积。含硫氨基酸半胱氨酸的氧化还原化学使其成为年龄相关修饰的关键靶点及细胞抗氧化损伤防御的核心。传统观点认为半胱氨酸修饰主要影响蛋白质功能，但新兴证据表明蛋白质功能也可通过细胞内向无膜区室的相变（即液-液相分离，LLPS）来调控。在衰老大脑中，胱硫醚γ-裂解酶（CSE）表达下降与阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经退行性疾病相关；CSE衍生的H₂S介导的蛋白质过硫化（PSSH）被认为可保护蛋白质过度氧化。然而，年龄诱导的半胱氨酸修饰从PSSH向亚磺酸（PSOH）及磺酸（PSO₃H）转变是否及如何影响蛋白质LLPS并促进聚集，尚不清楚。该研究即在此背景下，探讨衰老大脑中半胱氨酸PTM重编程通过LLPS驱动病理凝聚的机制，论文发表于《Nature Structural & Molecular Biology》。

主要关键技术方法

研究人员构建小鼠前额颞叶皮层样本队列（10周、10月、18月野生型及10周Cse^?/?小鼠），结合选择性化学蛋白质组学探针（BTD标记PSOH、dimedone-switch标记PSSH、NBF-Cl阻断所有硫醇以检测PSO₃H）进行全蛋白质组半胱氨酸修饰定量；辅以无标记总蛋白质组学排除表达量干扰；利用体外重组synapsin 1与G3BP2不同氧化还原态（还原态PSH、PSOH、PSSH、过氧化态PSO_xH）在拥挤剂或RNA存在下的LLPS与FRAP分析；在小鼠原代神经元、MEF、STHdh纹状体细胞及人原代成纤维细胞中通过H₂S供体（GYY4137、Na₂S）与CSE抑制剂处理，监测应激颗粒（SG）动力学与突触囊泡释放；采用filter trap、Gallyas银染、热位移蛋白质组学评估聚集倾向；并通过生存曲线分析Cse^?/?小鼠寿命。

研究结果

衰老伴随蛋白质组范围PSOH升高与PSSH降低

研究人员在小鼠前额颞叶皮层通过化学蛋白质组学发现，PSOH随年龄稳态上升，涉及代谢、突触传递、蛋白折叠等通路；PSSH呈非线性下降，中年（10月）降幅最显著，部分蛋白至18月部分恢复。约37%的蛋白同时呈现PSSH降与PSOH升。Cse^?/?小鼠在10周即重现老年WT的硫醇重编程，证实CSE是脑内PSSH/PSOH转换的关键调节者。

CSE是衰老脑中PSOH向PSSH切换的关键调节者

Cse^?/?小鼠脑内PSOH与PSO₃H显著升高，PSSH普遍降低，与衰老重叠通路一致；Vienna-PTM模拟显示半胱氨酸磺酸化引起β片层/环区构象改变，PRDX与DJ-1磺酸化水平随龄及CSE缺失上升。

年龄诱导的PSSH向PSO₃H转变在Cse^?/?小鼠更显著

NBF-Cl裂解液LC-MS直接检出磺酸化肽段，老化与Cse^?/?均新增独特磺酸化位点；结构预测提示磺酸化引入刚性强负电SO₃H锚点。

年龄诱导半胱氨酸PTM促成synapsin 1的LLPS

synapsin 1的C360在老年及Cse^?/?呈现PSOH升、PSSH降、PSO₃H出现。体外显示PSO_xH态液滴更大、FRAP更快，PSSH态液滴更小、扩散慢；相图表明仅约3%磺酸化即足以降低相分离阈值。原代神经元中H₂S加速KCl诱导的synapsin 1分散与递质释放，CSE抑制则延迟释放。

G3BP2中C73是SG形成的调节位点

G3BP2唯一半胱氨酸C73在老年/Cse^?/?脑内PSOH升、PSSH降（年轻WT约65%为PSOH、20%为PSSH）。体外RNA诱导相分离中PSO_xH态液滴小且FRAP慢，PSOH态扩散快；C73S突变MEF或无CSE的MEF在砷酸盐应激下SG提前形成、解聚迟滞，FRAP慢于WT。

G3BP2过硫化导致SG解聚

应激时全局PSOH升、PSSH降，恢复阶段反向；H₂S或PSSH处理使预成型G3BP2液滴溶解，C73S突变体不响应。Cse^?/? MEF、Q111纹状体细胞及79岁人成纤维细胞SG解聚缺陷，GYY4137可挽救老年供体细胞表型。

年龄诱导 redox 失衡导致蛋白质聚集

Cse^?/?细胞热稳定性 assay 显示H₂O₂下蛋白质组更易失稳聚集；18月Cse^?/?脑filter trap中Aβ与TIA-1聚集显著多于WT，Gallyas染色见神经突样斑块，寿命较WT显著缩短。

讨论与结论翻译

讨论指出，H₂S与LLPS均为生命起源与细胞稳态核心。衰老脑内ROS稳态被打破，PSOH连续累积终成PSO₃H，而内源H₂S缓冲此过程。PSSH通过侧链延长的S–S交换与溶剂化充当“抗黏附”修饰，解散凝聚；不可逆PSO₃H则似磷酸化增强黏附促相分离。SG在老年因PSSH亏缺而解聚失败，形成“氧化蛋白滞留—异常稳定—聚集”自强化环路。Cse^?/?小鼠为此提供模型。硫化物供体（GYY4137）与麦角硫因（ET，经CSE产H₂S恢复PSSH）可 dissolution 病理凝聚，ET临床关联认知减缓支持该机制。结论：年龄相关半胱氨酸PTM从PSSH向PSOH/PSO₃H偏移重编程LLPS，CSE–H₂S–PSSH轴是拮抗大脑病理相分离的可成药节点。