p21激活激酶4通过磷酸化YAP的T428位点驱动肝星状细胞活化和肝纤维化

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：p21-activated kinase 4 drives hepatic stellate cell activation and liver fibrosis through the phosphorylation of YAP at T428

　　

理解调控肝星状细胞（HSC）命运的分子机制对于开发有效的抗纤维化疗法至关重要。Yes相关蛋白（YAP）在器官纤维发生和HSC活化中发挥关键作用，但其在肝纤维化中的上游调控信号仍 largely unknown。在此，研究人员证明了p21激活激酶4（PAK4），一个新兴的治疗靶点，在YAP的活化性磷酸化及随后的HSC活化中的作用。在来自肝纤维化患者和小鼠的活化HSC中，PAK4表达显著上调，并与疾病严重程度相关。沉默PAK4抑制了HSC活化的标志性特征，包括纤维化活性、增殖、迁移和收缩性。HSC特异性敲除Pak4以及口服选择性PAK4抑制剂减轻了小鼠肝纤维化。机制上，PAK4直接磷酸化YAP的T428位点（一个先前未识别的位点），导致YAP稳定、核积累和转录激活，进而促进HSC活化。在HSC中过表达磷酸化失活的YAP突变体减少了纤维发生，验证了PAK4介导的YAP磷酸化的功能重要性。值得注意的是，在纤维化患者的肝脏中，T428磷酸化YAP水平显著升高。研究人员的发现揭示了HSC中一个新的PAK4-YAP信号轴，即PAK4介导的YAP T428磷酸化促进其活化并驱动肝纤维化。这些见解突出了靶向HSC活化的一种潜在治疗策略。

**论文解读**

**研究背景与问题**

肝纤维化是多种慢性肝病（如代谢功能障碍相关脂肪性肝病，MASLD）进展为肝硬化和肝细胞癌的关键病理过程，其核心特征为细胞外基质（ECM）的过度积累。尽管针对代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）伴纤维化的药物（如resmetirom和semaglutide）已获批准，但直接且强效靶向肝纤维化及肝硬化的有效治疗策略仍然有限，存在巨大的未满足医疗需求。肝星状细胞（HSC）是肝纤维化过程中产生ECM的主要细胞，在健康肝脏中处于静息状态，而肝损伤后则转分化为肌成纤维细胞样细胞，呈现活化表型。因此，调控HSC活化被认为是管理肝纤维化的有前景策略。然而，HSC活化及其病理表型由复杂信号通路调控，阐明控制HSC命运的具体机制对于开发有效抗纤维化疗法至关重要。

Yes相关蛋白（YAP）是Hippo信号通路下游的关键效应分子，在器官纤维发生和HSC活化中发挥核心作用。YAP作为转录共激活因子，与转录增强关联域（TEAD）家族协同调控下游靶基因表达。然而，YAP在肝纤维化中的上游调控信号，特别是其活化机制（不同于已知的由大肿瘤抑制激酶（LATS）介导的抑制性磷酸化），仍知之甚少。p21激活激酶4（PAK4）属于II组PAK家族，在癌细胞中升高并与细胞骨架重塑和细胞生长相关，但其在非癌细胞中的病理生理作用，尤其在HSC活化中的角色，此前尚未被探索。

**研究开展与结论**

本研究发现PAK4在活化HSC中表达上调，并揭示了一条先前未知的促纤维化PAK4-YAP信号轴：PAK4直接磷酸化YAP的T428位点（此前未识别），导致YAP激活及随后的HSC活化，从而驱动肝纤维发生。研究人员通过多种肝纤维化动物模型（包括CCl4、BDL和CDAHFD）结合HSC特异性Pak4敲除或PAK4药理学抑制，以及组学分析、突变体和分子对接等互补方法，验证了该机制。临床相关性通过分析肝纤维化患者肝脏组织样本（使用新开发的抗T428磷酸化YAP抗体）得到确认。该研究证实PAK4是HSC活化的重要调控因子，其抑制可有效减轻肝纤维化，为靶向HSC活化提供了新策略。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用多种模型：CCl4、BDL、CDAHFD诱导的小鼠肝纤维化模型；基因编辑小鼠（Pak4^f/f;Pdgfrb-Cre^ERT2）实现HSC特异性Pak4敲除；Col1a1启动子驱动的慢病毒载体实现HSC特异性Yap过表达。样本队列来源：人类肝组织样本来自Jeonbuk National University Hospital（2017-2023年），按METAVIR分期分类。主要技术包括：Western blot、免疫荧光、qPCR、RNA-seq、基因本体分析、基因集富集分析、免疫共沉淀、体外激酶分析、液相色谱-串联质谱、分子对接模拟、荧光素酶报告基因检测、环己酰亚胺追踪实验、泛素化检测、以及使用PAK4选择性抑制剂ND201651进行体内外药理学干预。

**研究结果**

**PAK4在人类和小鼠肝纤维化的活化HSC中上调**
通过CCl4、BDL、CDAHFD模型及患者样本，免疫荧光共染显示PAK4与α-SMA阳性细胞共定位显著增加，且PAK4在活化HSC中mRNA和蛋白水平均升高。转录因子HIF-1α和YY1直接结合PAK4启动子，调控其转录上调。

**PAK4缺失抑制体外HSC活化**
从Pak4^f/f小鼠分离原代HSC，利用腺病毒或siRNA敲除PAK4后，α-SMA和COL1A1表达降低，纤维化基因转录下降，且HSC增殖、迁移、收缩能力均受抑制。RNA-seq显示ECM组织、细胞迁移和增殖相关基因显著改变，胶原形成相关基因下调。

**HSC中PAK4缺失减轻体内肝纤维化**
在Pak4^f/f;Pdgfrb-Cre^ERT2小鼠中，HSC特异性Pak4敲除（Pak4^ΔHSC）显著降低CCl4和BDL模型中的胶原沉积（天狼星红、Masson染色）、羟脯氨酸含量及α-SMA表达，并减少纤维化基因转录。HSC增殖（PCNA/α-SMA双阳性）减少，而凋亡未受影响。血清ALT/AST无显著变化，表明PAK4效应主要限于HSC。

**PAK4稳定活化HSC中的YAP**
KEGG分析显示Hippo通路在PAK4缺失HSC中显著改变，YAP是关键分子。PAK4过表达增强YAP转录活性（荧光素酶报告基因）及靶基因（CTGF, CYR61）表达，而PAK4沉默降低YAP蛋白水平但不影响mRNA。CHX追踪实验表明PAK4增加YAP蛋白稳定性，并通过泛素-蛋白酶体降解抑制其泛素化，且该效应依赖PAK4激酶活性。E3连接酶β-TRCP（而非FBXW7）介导PAK4沉默所致的YAP不稳定。

**PAK4直接磷酸化YAP的T428位点促进其活化**
Co-IP和PLA证实PAK4与YAP结合，但不与TAZ结合。体外激酶分析显示PAK4直接磷酸化YAP，且主要磷酸化苏氨酸残基。通过肽竞争、LC-MS/MS及分子对接，鉴定T428为PAK4特异性磷酸化位点。生成磷酸化特异性抗体，验证PAK4过表达增加T428磷酸化，沉默则降低。T428A突变体（磷酸化失活）降低PAK4诱导的苏氨酸磷酸化，增加泛素化和降解，减少核定位和转录活性；而T428E突变体（磷酸化模拟）相反。PAK4对YAP的作用不依赖于LATS1，且T428磷酸化可抵抗LATS1介导的降解。

**HSC中过表达磷酸化失活Yap^T413A突变体减轻肝纤维化**
在CCl4小鼠中，HSC特异性过表达WT-Yap（通过慢病毒）增强胶原沉积，而过表达Yap^T413A（小鼠对应T428）突变体则抑制胶原沉积，降低纤维化基因和YAP靶基因表达。患者样本中，YAP在活化HSC中表达升高，并与PAK4表达正相关，T428磷酸化YAP水平在纤维化和肝硬化患者中显著升高。

**PAK4抑制剂药理学给药改善肝纤维化**
口服PAK4抑制剂ND201651处理原代小鼠HSC，降低YAP蛋白及靶基因，抑制α-SMA和胶原基因表达。在CCl4小鼠模型中，ND201651（10或30 mg/kg）抑制YAP及靶基因，降低PAK4活性和YAP T428磷酸化，减少胶原沉积和纤维化基因表达，且30 mg/kg组降低血清ALT/AST，恢复体重。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，PAK4作为YAP的新型活化激酶，其调控机制独立于经典Hippo通路中的LATS1。PAK4通过磷酸化YAP T428位点，稳定YAP蛋白并促进其核定位和转录活性，从而驱动HSC活化。PAK4在HSC中由HIF-1α和YY1转录上调，且其表达调控具有情境依赖性。PAK4抑制不仅影响HSC，还可能通过保护肝细胞产生协同抗纤维化效果。与整体YAP/TAZ抑制相比，PAK4选择性靶向YAP而不结合TAZ，可能减少副作用。此外，PAK4抑制还具有抗肥胖和抗糖尿病等代谢益处，并可能抑制肝癌发生，显示出多靶点治疗潜力。研究结论总结为：“总之，研究人员确定PAK4是一个关键调控因子，在纤维化HSC的转录重编程过程中上调，通过T428磷酸化介导的YAP稳定化和转录激活，驱动HSC活化和肝纤维发生。这些发现为开发针对肝纤维化中HSC活化的治疗干预提供了新视角，并提出了对其他YAP相关病理状态的更广泛临床意义。”