灵长类小脑发育中转座元件驱动的基因调控创新

《Nature Communications》：Gene regulatory innovations from transposable elements in primate cerebellum development

　　

转座元件（Transposable elements, TEs）被认为驱动了基因调控创新，但其在细胞类型水平上对灵长类大脑发育的贡献仍未得到充分探索。在此，研究人员利用来自人类、猕猴、狨猴和小脑的单细胞多组学数据，表明转座元件对不同细胞类型的贡献受不同细胞类型间不同程度的约束以及特定细胞状态中某些转座元件的优先共选（co-option）所塑造。利用一个预测细胞类型特异性染色质可及性的基于序列的深度学习模型，研究人员系统地评估了转座元件共选入小脑基因调控网络的潜力，鉴定了12个转座元件亚家族，其祖先状态具有复杂的调控序列，促进了它们作为细胞类型特异性顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）的共选。这些祖先调控序列的保存以及插入位点周围活跃的染色质环境，是现存拷贝可及性的主要决定因素。谱系特异性可及性拷贝促成了人类特异性基因表达。广泛而言，研究人员展示了转座元件如何被灵活地共选入细胞类型特异性基因调控网络，并介绍了一个可推广的分析框架，用于解析它们对哺乳动物调控进化的贡献。

大脑进化的遗传基础，尤其在灵长类谱系中，仍不完全清楚。小脑在灵长类进化中经历了神经元数量的显著扩张，与大脑皮层并行，小脑颗粒细胞（cerebellar granule cells）——来源于后脑上菱唇（upper rhombic lip），约占人大脑所有神经元的80%——在此扩张中起核心作用。影响基因表达的基因调控变化被认为是此类进化创新的关键，因为它们能够在不破坏必需功能的情况下修改特定细胞过程。这些调控变化主要通过顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）如启动子和增强子的修饰发生，这些元件被转录因子（transcription factors, TFs）结合，并以细胞类型特异性方式调控基因。许多进化变化源于单核苷酸替换和小插入缺失（indels）。转座元件（transposable elements, TEs）提供了另一种调控创新机制，这些DNA序列能够自我复制和基因组转位，长期以来被认为通过扩增携带TF结合位点的拷贝来重连基因调控网络，从而参与转录调控。然而，TEs对调控创新的贡献程度和机制仍存在争议：首先，尽管TEs占人类基因组的45-70%，但它们在CREs中的代表性低于其基因组丰度；其次，TEs与调控区域的关联可能部分反映其固有的插入位点偏好；第三，影响基因表达的TE插入常被净化选择迅速消除；第四，以往大多数研究缺乏细胞类型分辨率，限制了对TEs在基因调控中作用的理解，尤其对于发育中大脑这样细胞高度复杂的组织。研究人员的前期工作已表征了哺乳动物小脑发育中不同细胞类型的CRE和基因表达创新，并开发了深度学习模型DeepCeREvo，该模型学习了小脑细胞类型特异性CRE的序列语法，并应用于240种哺乳动物基因组，以理解向人类谱系进化中CRE和基因表达进化的遗传基础。然而，TEs对这些CRE创新以及小脑细胞类型整体调控景观的贡献仍未被探索。在本研究中，研究人员结合人类、猕猴、狨猴和小鼠小脑发育细胞类型的单细胞多组学数据集，以及基于序列的深度学习模型，系统研究了TEs如何塑造小脑发育中的基因调控进化。

研究人员开展了以下研究：利用来自人类、猕猴、狨猴和小鼠小脑发育的单细胞多组学数据（snRNA-seq和snATAC-seq，样本队列来源于先前已发表的研究），结合深度学习模型DeepCeREvo（该模型预测细胞类型特异性染色质可及性），系统评估了TEs共选入小脑基因调控网络的潜力。通过计算机筛选，鉴定出12个TE亚家族，其祖先序列具有复杂调控序列，易于被共选为细胞类型特异性CREs。进一步分析表明，祖先序列的保存和插入位点周围活跃的染色质环境是现存拷贝可及性的主要决定因素，且谱系特异性可及性拷贝促成了人类特异性基因表达。该研究证明了TEs如何灵活地共选入细胞类型特异性基因调控网络，并提供了一个可推广的分析框架。论文发表在《Nature Communications》。

主要关键的技术方法包括：研究人员使用了来自人类、猕猴、狨猴和小鼠小脑发育的单细胞多组学数据（snRNA-seq和snATAC-seq），这些数据来源于先前已发表的研究。他们应用了基于序列的深度学习模型DeepCeREvo，该模型预测细胞类型特异性染色质可及性。通过对TE亚家族共识序列进行滑动窗口评估调控潜力，并结合细胞类型特异性cCRE的富集分析，筛选出12个候选TE亚家族。此外，还进行了荧光素酶报告基因实验验证HERVL的增强子活性，以及系统发育分析、多因素逻辑回归等方法来解析共选机制。

研究结果：

1. Factors shaping TE contributions to cerebellar cis-regulatory elements：通过分析人类小脑cCREs与TEs的重叠，发现17.6%的cCREs与TEs重叠（>250 bp），但经逻辑回归校正GC含量、可作图和距转录起始位点距离后，cCREs显著缺乏TEs（比值比OR=0.38，P<10^-15）。谱系特异性cCREs（如人类特异性、灵长类特异性）中TE重叠率远高于保守cCREs（人类特异性62%，灵长类特异性29%，哺乳动物保守5%）。此外，TE贡献随cCREs共享细胞类型数量增加而降低，且胚胎期和胎儿期细胞中TE重叠率低于成年期。这些结果表明，TEs对cCREs的贡献受不同细胞类型间约束程度的影响，更特化的后期发育细胞类型中TE共选更多。

2. Complex cis-regulatory sequences in ancestral TE sequences facilitate co-option of TEs：利用DeepCeREvo对TE亚家族共识序列进行调控潜力评估，结合细胞类型特异性cCRE富集，鉴定出12个TE亚家族。这些亚家族在祖先序列中包含转录因子结合基序（如E-box、NFI、POU、PU.1等），与相应细胞类型中活跃的转录因子匹配，提示其优先共选源于预存的调控序列。

3. Lineage-specific co-option of TE subfamilies as regulatory elements：以HERVL为例，其可及性在分化颗粒细胞中特异富集，并在菱唇来源的谷氨酸能神经母细胞中特异性可及，而非其他脑区。不同细胞类型使用不同的HERVL拷贝，且同一亚家族可被不同细胞类型通过不同基序共选，展示了TE共选的灵活性。

4. Subfamily-specific sequence substitutions create high regulatory potential in hindbrain neuroblasts：比较HERVL与近缘亚家族，发现HERVL在2000-2500 nt区域具有独特序列替换，形成了ATOH1和NFI结合位点，使其在菱唇来源神经母细胞中具有高增强子活性。荧光素酶报告实验证实HERVL序列在反向取向上具有显著增强子活性，而其他近缘亚家族无此活性。

5. Determinants of copy-level TE co-option：对HERVL拷贝的分析表明，可及性拷贝的DeepCeREvo预测分数显著更高（中位数0.72 vs 0.52），且祖先基序保存更好。但序列特征不能完全解释，周围染色质环境（如距非TE衍生cCRE的距离）也是重要决定因素。多因素逻辑回归确认DeepCeREvo预测分数（OR=1205，P<10^-6）和邻近cCRE距离（OR=0.28每log单位距离增加，P<10^-4）是主要预测因子。对于LTR1A2，还观察到通过趋同进化获得新基序的机制。

6. Species-specific TE co-option drives regulatory divergence in primate cerebellar development：比较人类、猕猴、狨猴和小鼠，发现HERVL、LTR1A2和MER52D的拷贝在灵长类中特异性可及，且人类特异性可及性拷贝与附近基因（如C9orf72、MGST2）在分化颗粒细胞中的表达升高相关，表明TE共选驱动了物种特异性基因表达差异。

总结讨论部分：研究人员讨论了TEs的优先共选机制，特别是LTR族在早期胚胎发生中的作用，以及本研究通过单细胞分辨率鉴定了12个TE亚家族，包括内部序列类型的HERVL和ERVL-B4，表明非经典TE类也可被共选。HERVL和LTR1A2展示了不同的共选模式：HERVL具有“即用型”预适应序列，而LTR1A2通过趋同进化获得新基序。此外，进化约束广泛影响TE衍生cCRE的分布：这些cCRE富集于较少约束的基因组环境中（远端元件、物种特异性区域、细胞类型特异性元件、后期发育阶段活跃的元件）。研究局限性包括短读段测序对长TEs的挑战以及模型输入窗口较小（500 bp），未来可应用更大窗口模型（如Borzoi或AlphaGenome）进行更完整分析。研究结论：研究人员的工作提供了一个框架，用于研究转座元件对不同细胞类型中顺式调控景观和基因调控进化的贡献。该方法可扩展到小脑发育之外，通过整合大规模染色质可及性图谱与基于序列的深度学习模型。总之，本研究的框架和发现可能有助于未来研究转座元件对基因调控进化以及最终对生物体表型的贡献。