胎盘间充质干细胞通过调节TGF-β1信号通路促进脑缺血再灌注大鼠星形胶质细胞向A2表型极化

《Biomolecules》：Placental Mesenchymal Stem Cells Promote the Polarization of Astrocytes Towards the A2 Phenotype by Modulating the TGF-β1 Signaling Pathway in Cerebral Ischemia–Reperfusion Rats

　　

星形胶质细胞功能失衡是影响脑缺血康复的关键因素。间充质干细胞（MSCs）对脑缺血具有治疗潜力，但其机制尚不明确。本研究探讨了胎盘间充质干细胞（PMSCs）如何促进星形胶质细胞向有益于脑缺血损伤修复的A2表型极化。研究人员建立了大脑中动脉缺血/再灌注动物模型和体外白细胞介素-1β（IL-1β）处理的星形胶质细胞炎症模型，并利用神经功能评估、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色、免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blotting）等方法评估将PMSCs移植至脑缺血-再灌注损伤大鼠中的影响及相关机制。结果表明，PMSCs移植改善了神经功能障碍和组织病理学损伤，减轻了神经炎症并增强了神经营养因子水平，促进了IL-1β处理的星形胶质细胞向A2表型极化，并抑制了缺血/再灌注模型中脑内TGF-β1/Smad信号级联核心介质的丰度。总之，PMSCs移植通过调控缺血性脑损伤中的TGF-β1/Smad信号级联，促进了脑星形胶质细胞向保护性A2表型极化。

**论文解读：胎盘间充质干细胞通过调节TGF-β1信号通路促进脑缺血再灌注大鼠星形胶质细胞向A2表型极化**

**研究背景与问题**
缺血性脑卒中是全球性的重大公共卫生挑战，致死率与致残率居高不下，但有效治疗手段有限。脑缺血再灌注损伤（CIRI）是缺血性脑卒中恶化的核心病理机制，其关键驱动因素之一为神经炎症。星形胶质细胞在CIRI相关神经炎症中发挥重要调节作用，并可分为两种功能亚型：促炎性A1表型和神经保护性A2表型。过度激活的A1星形胶质细胞释放大量炎症介质，加剧神经损伤，因此星形胶质细胞成为治疗CIRI的重要靶点。转化生长因子-β（TGF-β）信号通路在星形胶质细胞激活及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达中起关键调控作用。然而，胎盘间充质干细胞（PMSCs）是否通过调节星形胶质细胞的TGF-β1信号通路发挥抗炎效应尚不明确。本研究旨在明确PMSCs移植能否通过调节TGF-β1/Smad信号轴，驱动有害A1星形胶质细胞向神经保护性A2表型转化，从而抑制神经炎症，为CIRI的临床转化提供依据。

**主要技术方法**
1. 动物模型：采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（来源：宁夏医科大学实验动物设施），建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型，缺血90分钟后恢复血流。
2. 细胞培养：PMSCs（第五代）由宁夏干细胞与再生医学重点实验室提供，源自人胎盘组织，具有MSC表型特征（CD73、CD90、CD105阳性；CD14、CD45、CD34、HLA-DR阴性）。原代皮层星形胶质细胞取自出生1-3天新生大鼠，GFAP免疫荧光鉴定纯度>80%。体外炎症模型：IL-1β（100 ng/mL）刺激星形胶质细胞24小时。
3. PMSCs移植：MCAO/R后当日，经立体定位注射向大鼠脑内移植1×10⁶个PMSCs（30 μL悬浮液），假手术组注射等量PBS。
4. 神经功能评估：采用Zea Longa评分和改良Garcia评分系统。
5. TTC染色：测定脑梗死体积。
6. 组织病理学：HE染色、尼氏染色。
7. 免疫荧光染色：检测GFAP、iNOS（A1标记）、Arg-1（A2标记）。
8. 蛋白质印迹（Western blotting）：检测GFAP、GDNF、Arg-1、S100A10、TGF-β1、TβRI、TβRII、p-Smad2/3、C3、IL-6等蛋白表达。
9. 实时定量PCR（qRT-PCR）：检测IL-1β、IL-6、TNF-α、Arg-1、NGF、BDNF、TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3等mRNA水平。
10. ELISA：检测细胞培养上清中TNF-α和IL-6浓度。
11. 统计学分析：使用GraphPad Prism 9.0，单因素方差分析（ANOVA）及Tukey HSD事后检验，p<0.05为显著性差异。

**研究结果**
**3.1 PMSCs移植改善了MCAO/R大鼠的神经功能障碍和组织病理学损伤**
Zea Longa评分和改良Garcia评分显示，PMSCs移植显著促进了MCAO/R大鼠的神经功能恢复（n=10）。TTC染色定量分析表明，PMSCs组脑梗死体积较MCAO/R组显著减小（n=3）。HE染色和尼氏染色显示，PMSCs组脑组织病理损伤（细胞排列紊乱、核固缩、神经元缺失等）明显减轻，尼氏体数量增加（n=5）。

**3.2 PMSCs移植减轻了脑缺血再灌注后的神经炎症并增强了神经营养因子水平**
qRT-PCR结果显示，与MCAO/R组相比，PMSCs组脑组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达显著降低，而抗炎因子Arg-1的mRNA表达显著升高（n=3）。同时，神经营养因子NGF、BDNF的mRNA水平以及GDNF的蛋白水平在PMSCs组均显著上调（n=3）。

**3.3 PMSCs移植促进了星形胶质细胞向A2表型极化**
免疫荧光双标染色显示，PMSCs组GFAP/iNOS（A1标记）双阳性细胞比例较MCAO/R组显著降低，而GFAP/Arg-1（A2标记）双阳性细胞比例显著升高（n=5）。Western blotting进一步证实，PMSCs组Arg-1和S100A10（A2标记）蛋白表达上调，而GFAP蛋白表达下调（n=3）。

**3.4 PMSCs移植减弱了MCAO/R大鼠脑内TGF-β1信号通路相关因子的表达**
qRT-PCR和Western blotting结果显示，MCAO/R组TGF-β1、TβRI、TβRII、Smad2、Smad3的mRNA以及TGF-β1、LAP-TGF-β1、TβRI、TβRII、p-Smad2/3的蛋白表达均显著高于假手术组；而PMSCs移植可显著逆转这些上调（n=3）。

**3.5 PMSCs处理促进了IL-1β处理的星形胶质细胞从A1向A2亚型极化**
体外实验中，IL-1β刺激星形胶质细胞后，ELISA显示IL-6和TNF-α分泌增加；qRT-PCR显示IL-6和TGF-β1 mRNA上调；免疫荧光显示iNOS荧光强度增加，Arg-1荧光强度无显著变化；Western blotting显示C3、αC3、GFAP、IL-6蛋白上调，Arg-1蛋白下调。而与IL-1β组相比，PMSCs共培养（以及TGF-β1信号通路抑制剂SB-431542处理）均显著降低了IL-6、TNF-α分泌，下调了IL-6、TGF-β1 mRNA表达，增强了Arg-1荧光强度，降低了iNOS荧光强度，并下调了C3、αC3、GFAP、IL-6蛋白，上调了Arg-1和S100A10蛋白（n=3-5）。

**3.6 PMSCs处理减弱了星形胶质细胞中TGF-β信号通路相关因子的表达**
Western blotting显示，IL-1β刺激后星形胶质细胞中TGF-β1、TβRI、TβRII、p-Smad2/3蛋白表达显著上调；PMSCs处理可显著下调这些蛋白表达（n=3），而SB-431542仅对TGF-β1、TβRI、TβRII有显著下调作用，对p-Smad2/3的下调未达统计学显著性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，CIRI病理涉及多种细胞和通路。PMSCs具有免疫调节和抗炎特性，本研究证实PMSCs移植可改善MCAO/R大鼠运动功能、减少梗死体积、减轻神经元损伤，并通过降低促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和增加抗炎因子（Arg-1）及神经营养因子（NGF、BDNF、GDNF）来调节炎症微环境。星形胶质细胞在CIRI中经历A1/A2极化，PMSCs可驱动其向保护性A2表型转化，这与抑制TGF-β1/Smad信号通路相关。体内外实验均显示PMSCs抑制了TGF-β1、TβRI、TβRII、p-Smad2/3的表达，从而削弱A1型星形胶质细胞激活。研究局限性包括：仅使用有限的A1/A2标记物，机制证据以关联性为主，未设置长期观察终点，以及PMSCs临床转化面临存活率低、免疫风险、制备标准不一致等问题。
**结论翻译**：研究人员的结果表明，PMSCs移植可能通过调节TGF-β1信号通路减轻MCAO/R引发的神经炎症，潜在地将反应性A1星形胶质细胞转化为保护性A2表型。