基于环介导等温扩增的侧流层析试纸条技术用于唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种快速可视化检测

《Molecules》：A Novel LAMP-Based Lateral Flow Dipstick Technique for Rapid and Visual Detection of Burkholderia gladioli pv. cocovenenans

　　

唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）椰毒致病变种（pv. cocovenenans）是唐菖蒲伯克霍尔德菌最具代表性的致病变种，能够产生耐热且高毒力的椰毒假单胞菌酵米面亚种酸（bongkrekic acid，BA），可导致人体多器官衰竭及极高病死率。本研究旨在挖掘唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的特异性靶标，并开发食品中该致病变种快速准确的检测方法。研究人员通过泛基因组分析成功筛选获得两个新型特异性靶基因（group_0918和group_0110），并与聚合酶链反应（PCR）对比验证了两靶标的优异特异性和敏感性。基于上述靶标建立了特异性鉴定该致病变种的环介导等温扩增（LAMP）方法，在纯培养物和加标鲜黑木耳样品中，对唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种的检测限（LOD）分别达4.1×101 CFU/mL和4.1×102 CFU/g。为实现点状护理检测（POCT），研究人员构建了LAMP偶联侧流层析试纸条（LFD） assay，在鲜黑木耳中检测灵敏度为4.1×103 CFU/g。自然污染食品样品测试表明，所建LAMP及LAMP辅助可视化检测可作为准确鉴定该致病变种的有效替代方案。本研究建立的新型分子检测技术为防控食品中唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种污染提供了高效可靠方法，具有重要应用价值与推广前景。

研究背景与立项依据

唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）椰毒致病变种（pv. cocovenenans）为革兰阴性菌，广泛存在于空气、土壤及水体，可分泌椰毒假单胞菌酵米面亚种酸（BA）与毒黄素（toxoflavin，TF）两类致死毒素，引发肝昏迷、神经功能障碍并以呼吸衰竭致死，人群病死率超40%，高于单核增生李斯特菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌等常见食源性病原体。该致病变种在印尼、亚洲长期流行，2015年莫桑比克暴发致75人死亡，2024年北美报告首例BA中毒死亡，中国2005—2020年统计30起中毒事件致188人患病85人死亡，主要污染黑木耳、银耳、发酵米面制品及淀粉类食品。现行国标GB 4789.29-2020以预增菌、分离纯化、生化鉴定及产毒分析为金标准，流程繁琐耗时；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）依赖贵重仪器与数据库且仍需预培养；常规PCR需热循环仪难以下沉基层；传统LAMP依赖琼脂糖凝胶电泳判读易致气溶胶污染。已有分子标记如16S rRNA、23S rRNA、16S-23S rRNA间隔区及毒力基因bonM同源性高或变异大，难以精准鉴别。研究人员因此基于501株基因组（489株伯克霍尔德菌属加12株其他食源性致病菌）开展泛基因组分析挖掘新型靶标，进而建立LAMP及LAMP-LFD可视化平台，论文发表于《Molecules》。

主要关键技术方法

研究人员采用Perl本地脚本联合Prokka v1.11与Roary v3.11.2（BLASTP一致性阈值85%）进行泛基因组比对，以靶菌株100%覆盖、非靶0%覆盖初筛候选靶标，并经本地BLASTN及NCBI nt库验证；靶标经普通PCR与qPCR（TB Green体系）评估特异性和灵敏度后选group_0918设计LAMP引物（F3/B3、FIP/BIP、LF/LB）；LAMP体系含Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、10×等温缓冲液、Mg²⁺、dNTPs，65℃恒温扩增后85℃灭活；可视化端自行搭建硝基纤维素膜试纸条，T线包被抗生物素抗体、C线包被羊抗鼠二抗，扩增产物双标地高辛（DIG）与生物素，与抗DIG修饰Au@PDA探针杂交后层析显色；样本端涵盖纯菌液、人工加标鲜黑木耳（CICC25108梯度10⁰~10⁷ CFU/g）及自南昌农贸市场采集22份自然样品（鲜黑木耳与湿米粉各11份，含阳性对照），以国标法平行比对。

研究结果

2.1 新型特异性靶标筛选：研究人员收集501条基因组，经泛基因组分析获group_0918与group_0110两个候选（均编码假设蛋白），本地BLASTN显示其在靶菌株100%检出、非靶100%特异，优于bonM（非靶特异仅98.3%）；两对引物PCR在全部靶菌株扩增、非靶无带，qPCR在加标黑木耳LOD为4.1×10² CFU/g，依扩增效率与引物表现选group_0918进入下游。

2.2 LAMP可视化assay验证：基于group_0918设计六引物，确立25 μL体系（引物比F3/B3:LB/LF:FIP/BIP=1:4:8，0.2 μmol/L为1单位）65℃反应后85℃灭活10 min；产物10倍稀释取80 μL加2 μL抗DIG-Au@PDA探针混匀上样，T线捕获生物素化扩增子、C线捕获游离探针，无模板仅C线单带，优化运行缓冲液表面活性剂防非特异性吸附。

2.3 LAMP可视化方法敏感性：纯培养中常规LAMP LOD为4.1×10¹ CFU/mL，LFD LOD为4.1×10² CFU/mL，线性4.1×10²~4.1×10⁶ CFU/mL（R²未给但AB_T/AB_C标准曲线成立）；加标黑木耳中常规LAMP LOD 4.1×10² CFU/g，LFD LOD 4.1×10³ CFU/g，线性4.1×10³~4.1×10⁷ CFU/g（R²=0.95），低浓度段（<10⁴ CFU/g）因煮沸裂解法多糖蛋白抑制致残差偏大、线性稍差，但不影响POCT判定。

2.4 特异性：取6株靶菌株与14株非靶菌株，常规LAMP仅靶菌株出阶梯带，LFD仅靶菌株T+C双带，非靶全阴，证明靶标-引物组合对唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种专一。

2.5 自然样品应用：22份市售样品（10未知鲜黑木耳+1加标鲜黑木耳+10未知湿米粉+1加标湿米粉）经4~6 h GVC增菌后LAMP-LFD检测，仅2份加标阳性，20份未知阴性，与GB 4789.29-2020完全一致，因阳性数n=2致灵敏度95%CI较宽（34.2~100%），特异度与总符合率CI窄且与国标一致。

讨论与结论浓缩

讨论指出，传统培养法多步耗时、单基因（recA/hisA/gyrB/16S）系统发育分辨力不足、bonM等旧靶受水平转移与变异干扰；本研究以全基因组比对替代片段策略，group_0918/0110源于种间水平转移获稳保守，假设蛋白功能注释待补。LAMP-LFD单检成本约￥20，低于培养￥132与商业qPCR￥50，灵敏度较Zheng等（2025）biotin-FITC LFD、Yao等（2025）Fe₃O₄@PDA双读值生物传感器各有优劣，现场端免热循环仪与电泳。22份试点样本仅覆盖黑木耳与湿米粉两类基质，后续需扩样本量与基质种类；未来可耦联CRISPR/Cas与微流控芯片免预扩增高通量分型。

结论部分原文意译：研究人员基于泛基因组分析成功挖掘唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种特异性分子靶标，建立LAMP-LFD现场可视化检测；相较传统培养法成本更低、操作更简，加标鲜黑木耳中LAMP LOD 4.1×10² CFU/g、LFD LOD 4.1×10³ CFU/g；该策略可作培养法可信替代，为食品中该致病变种毒力谱与流行病学分布研究提供技术支撑。