中国江苏省鸡源禽流感（H9N2）病毒遗传与致病性研究（2025年）

《Microorganisms》：Genetic and Pathogenicity Studies of Avian Influenza (H9N2) Virus Isolated from Chickens in Jiangsu Province, China, in 2025

　　

本研究于2025年3月在中国江苏省分离到一株H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）。系统发育分析显示，该H9N2分离株的血凝素（hemagglutinin，HA）基因片段属于B4.7谱系，其余7个片段均属于欧亚谱系。该H9N2病毒在演化过程中经历了中国多个区域的复杂基因重配，并鉴定到关键氨基酸替换，这些替换可能增强其病毒聚合酶活性及在小鼠中的复制效率。关键的是，小鼠实验表明，该H9N2病毒无需预先适应即可在BALB/c小鼠的肺和鼻甲中有效复制。此外，禽类感染研究显示，该H9N2病毒在鸡中的复制和传播效率高于鸭。而且，该病毒可通过感染鸡向接触鸭传播，其效率高于鸭-鸭传播。此外，在接种鸡和鸭的肺中，模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）和细胞因子的mRNA表达水平上调，而鸭的总升高倍数低于鸡。总之，这些结果强调了鸡源H9N2 AIV的潜在公共卫生风险，提示亟需加强对家禽中H9N2 AIV的常规监测。

**论文解读：2025年江苏省鸡源H9N2禽流感病毒的遗传与致病性研究**

**研究背景与问题**

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属于正黏病毒科A型流感病毒属，为有包膜、负义、分节段单链RNA病毒。根据表面血凝素（hemagglutinin，HA；18个亚型）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA；11个亚型）糖蛋白，A型流感病毒（influenza A viruses，IAVs）可分为不同亚型。除从蝙蝠分离的H17N10和H18N11外，所有已知HA和NA亚型均在野生水禽中鉴定到。AIV可根据鸡静脉内致病指数（intravenous pathogenicity index，IVPI）或HA裂解位点是否存在多碱性氨基酸，进一步分为高致病性AIV（highly pathogenic AIV，HPAIV）和低致病性AIV（low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）。高致病性禽流感（HPAI）的暴发对家禽养殖造成巨大损失，并对人类健康构成显著风险。尽管LPAIV致病性低于HPAIV，但其对公共卫生安全的潜在风险不容低估。例如，1999年至2023年，中国记录了H9N2、H6N1、H10N3、H3N8和H10N5亚型AIV的人感染病例。

H9N2 AIV于1966年首次在美国威斯康星州的火鸡中检测到，随后在非洲、亚洲和欧洲多个国家成为地方性流行。家禽，尤其是鸡，是H9N2病毒的主要宿主。有证据支持病毒从鸡向鸭传播，但这种跨物种传播的程度和机制仍不清楚。此外，这些病毒具有跨越物种屏障感染哺乳动物的潜力。已有报道从猪、黄鼠狼、狗、水貂甚至人类中分离到H9N2病毒。自1999年香港首次报道人感染H9N2病毒病例以来，多个国家相继发现人感染病例。此外，1997年至2013年，非洲、亚洲、北美和中东地区报告了人感染的血清学证据。近年来，2015年至2025年持续有H9N2人感染病例的报道。更重要的是，H9N2病毒可将其部分甚至全部内部基因贡献给致死性AIV，如H7N9、H5N2、H10N8和H5N6 AIV，构成重大公共卫生危害。这些事实促使研究人员评估H9N2 AIV的跨物种感染风险。

2025年3月，研究人员在中国江苏省徐州市分离到一株鸡源H9N2病毒。通过检索GISAID数据库发现，过去三年内江苏省仅有两株具有全基因组序列的B4.7谱系H9N2 AIV被公开提交，即A/Suzhou/1209KS/2025和A/chicken/Jiangsu/M2342C45/2023，而本研究的分离株与这两株病毒存在显著氨基酸差异，分别有91个和90个不同位点。鉴于这种差异，研究人员研究了其遗传关系、基因重配、分子特征及其在鸡、鸭和小鼠中的致病性。

**主要关键技术方法**

1. **病毒分离与鉴定**：2024年9月至2025年12月期间，从中国8个省份（山东、江苏、河南、河北、广东、吉林、黑龙江、安徽）采集家禽样本（包括口咽拭子、泄殖腔拭子、气管和肺组织标本），共326份。样本经处理后接种11日龄无特定病原体（specific-pathogen-free，SPF）鸡胚进行病毒分离，通过血凝试验和反转录PCR（RT-PCR）结合Sanger测序进行鉴定。
2. **系统发育分析**：采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和GTR+G+I核苷酸替换模型，以1000次bootstrap重复，使用MEGA 11.0软件对每个基因片段进行系统发育分析，并根据97%序列一致性阈值进行基因片段分类。
3. **体内致病性与传播实验**：分别对3周龄SPF鸡和鸭进行鼻内接种10⁶ EID₅₀（50%胚胎感染剂量）的H9N2病毒，设立接触组（共饲养），在不同时间点采集拭子和器官进行病毒滴定，并检测血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）抗体。同时开展了鸡-鸭跨物种传播实验。对5周龄雌性BALB/c小鼠进行鼻内接种10⁶ EID₅₀病毒，评估病毒复制、体重变化和组织病理学。
4. **免疫基因mRNA表达分析**：利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测接种鸡和鸭在感染后1天和3天时肺组织中模式识别受体（如TLR3、TLR7、MDA5、RIG-I）和细胞因子（如IL-2、IL-6、IFN-α、IFN-β）的mRNA相对表达水平，以GAPDH为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算。

**研究结果**

**3.1 2025年中国江苏省鸡源H9N2 AIV的分离**
研究人员从江苏省徐州市的鸡中分离到一株H9N2 AIV，命名为A/chicken/Jiangsu/1/2025(H9N2)。感染鸡为3周龄白来航鸡，来自约15万只的商业鸡群，约60%的鸡群出现感染临床症状，近10,000只死亡。农场主确认该鸡群在暴发前未接种过H9N2 AIV疫苗。病鸡表现典型流感感染症状，包括精神沉郁、食欲不振、鼻分泌物、咳嗽和打喷嚏。尸检显示肺脏肿大、水肿、变黑、充血，伴弥漫性胸膜增厚和胸腔积液。

**3.2 鸡源H9N2 AIV的系统发育分析**
基于外部基因（HA和NA）的系统发育树，HA基因可归入G1、B1-B3和B4.1-B4.7共11个亚分支，本研究的H9N2 AIV分离株属于B4.7亚分支。NA基因属于欧亚谱系。所有内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）也均聚类在欧亚谱系内。

**3.3 鸡源H9N2 AIV携带与增强哺乳动物致病性和聚合酶活性相关的分子标志**
分子分析显示，该H9N2 AIV的HA裂解位点基序为PSRSSR/GLF，表明其为LPAIV。该分离株存在多个已报道可增强哺乳动物致病性和聚合酶活性的氨基酸替换，包括：PB2蛋白的I292V和A588V；PB1蛋白的D3V和D622G；PA蛋白的K356R；M1蛋白的N30D、I43M和T215A；以及NS1蛋白的P42S。

**3.4 鸡源H9N2病毒经历了复杂的基因重配**
通过比对GISAID和NCBI数据库中该病毒8个基因片段的最高同源性病毒，追溯了A/chicken/Jiangsu/1/2025(H9N2)的起源。HA、NA和M基因来源于鸡源H9N2病毒；PA基因来源于鸡源H3N8病毒；PB1和NS基因来源于鸡源H3N3病毒；PB2和NP基因均来源于同一鸭源H3N3分离株。这表明该H9N2病毒的出现源于多种LPAIV亚型之间的复杂基因重组。

**3.5 鸡源H9N2 AIV在鸡中的有效复制和传播**
通过鼻内接种3周龄SPF鸡10⁶ EID₅₀病毒，发现接种鸡出现一过性体重下降，此后体重仍低于对照组。病毒在所有检测器官中均有发现，滴度在3 dpi（感染后天数）达到峰值，6和9 dpi逐渐下降。在3和5 dpi，接种鸡和接触鸡的口咽（OP）和泄殖腔（CL）拭子中均检测到病毒。所有接种鸡和接触鸡在14和21 dpi均出现血清阳转。组织病理学检查显示接种鸡肺脏血管充血和轻度间质性炎性细胞浸润。总体而言，该H9N2病毒可在鸡中复制和传播，并诱导高HI抗体滴度。

**3.6 鸡源H9N2 AIV在鸭中的低效复制和传播**
通过鼻内接种3周龄SPF鸭10⁶ EID₅₀病毒，发现感染鸭在1 dpi出现轻微体重下降，9 dpi开始恢复，体重仍低于对照组。病毒在鸭中复制较差，3和6 dpi在多个器官中检测到低滴度病毒，9 dpi未检出。3和5 dpi，接种鸭和接触鸭的OP和CL拭子中均检出病毒，7 dpi仅接种鸭CL拭子和接触鸭OP拭子阳性。所有鸭存活且无临床症状，接种鸭在14和21 dpi出现血清阳转，接触鸭仅在14 dpi阳转。组织病理学显示接种鸭肺脏肺泡大量出血、淤血、血管内淤滞和少量纤维蛋白渗出。总的来说，鸡的病毒复制滴度高于鸭，但鸭中病毒仍具备水平传播能力。

**3.7 鸡源H9N2病毒可通过感染鸡传播给接触鸭**
研究人员将5只鸭与接种A/chicken/Jiangsu/1/2025(H9N2)的鸡同笼饲养。结果显示，所有接触鸭在3和5 dpi的CL和OP拭子中均检出病毒排毒，7 dpi仅在OP拭子中检出。所有接触鸭在14和21 dpi均出现血清阳转。这表明该病毒可通过鸡向鸭传播，且传播能力高于鸭-鸭传播。

**3.8 鸡和鸭对H9N2 AIV感染表现出不同的免疫应答**
利用RT-qPCR检测接种鸡和鸭在1和3 dpi时肺脏中免疫基因mRNA水平。在接种鸡肺脏中，TLR3、TLR7、MDA5、IL-2、IL-6、IFN-α和IFN-β的mRNA水平在1 dpi升高，3 dpi显著上调。在接种鸭肺脏中，1 dpi时TLR7、IL-6、IFN-α无显著升高，而TLR3、MDA5、RIG-I、IL-2和IFN-β显著升高；3 dpi时除TLR3外，其他所有检测免疫基因mRNA水平均显著升高。总体而言，与对照组相比，鸡和鸭肺脏中所有检测基因的mRNA表达水平在1和3 dpi均上调，且除TLR7和MDA5外，接种鸭中其他免疫基因的升高幅度总体低于鸡。

**3.9 鸡源H9N2病毒无需预先适应即可感染小鼠**
BALB/c小鼠接种10⁶ EID₅₀病毒后，1 dpi出现轻微体重下降，8 dpi开始恢复。3 dpi时，在所有3只接种小鼠的肺和鼻甲中均检测到病毒，肺中滴度范围为4.25-5.25 log₁₀ EID₅₀，鼻甲中为3.25-4.25 log₁₀ EID₅₀，其他器官（肾、脾、脑）未检出病毒。组织病理学显示接种小鼠肺脏肺泡壁增厚、肺泡间隔增宽、轻度血管周围出血、细支气管上皮脱落，偶见肺泡壁粒细胞浸润。该病毒未导致小鼠死亡，但能无需预先适应即感染BALB/c小鼠，在鼻甲和肺中有效复制并引起明显肺部病变。

**讨论与结论**

**讨论总结**：自1966年首次分离以来，H9N2 AIV已迅速传播，成为家禽中最普遍的AIV亚型。本研究中分离的A/chicken/Jiangsu/1/2025(H9N2)属于B4.7亚分支，其出现源于中国不同LPAIV亚型间的复杂基因重配，这种重配是AIV演化和大流行毒株出现的关键驱动力。该分离株携带多个可能增强哺乳动物致病性和聚合酶活性的氨基酸替换，但这些推断基于文献数据，未在本研究中经实验验证，需进一步功能研究确认，且跨亚型外推突变效应应谨慎解读。小鼠实验表明该鸡源H9N2毒株无需预先适应即可感染哺乳动物，在鼻甲和肺中有效复制。家禽实验显示该病毒在鸡中的复制和传播效率高于鸭，且可通过鸡向鸭传播，这种跨物种传播可能促进病毒持续循环，为宿主适应提供机会，类似活禽市场多禽种共养情景。免疫应答比较显示，鸡和鸭感染后肺脏免疫基因mRNA表达均上调，但鸭的升高幅度低于鸡，鸡中更高的病毒载量可能与过度炎症反应相关。研究未包含攻毒保护实验，无法评估疫苗逃逸潜力，但已有研究显示候选疫苗株R118-A可减少同源B4.7.4谱系H9N2 AIV的排毒并对异源B4.7.2谱系提供交叉保护。

**研究结论**：总之，新分离的H9N2 AIV属于欧亚谱系内的B4.7亚分支，是源于中国流行的多种AIV亚型的一株重配病毒。研究结果表明，本研究考虑的H9N2 AIV已获得若干哺乳动物适应性突变，无需预先适应即可在BALB/c小鼠中有效复制，并能在鸡和鸭中复制和传播。值得注意的是，该病毒还能从鸡传播给鸭。在接种H9N2 AIV后1和3 dpi，鸡和鸭的肺脏中免疫相关基因的mRNA表达上调。这些结果为了解鸡源H9N2 AIV的演化、致病特征和宿主抗病毒免疫应答提供了见解。该论文发表在《Microorganisms》期刊上。