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常见的基因定位方法主要包括数量性状位点作图(QTL-mapping)、混池分离分析测序(BSA-seq，又称QTL-seq)和全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study，GWAS)。BSA-seq旨在以经济高效的方式促进数量性
常见的基因定位方法主要包括数量性状位点作图(QTL-mapping)、混池分离分析测序(BSA-seq，又称QTL-seq)和全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study，GWAS)。BSA-seq旨在以经济高效的方式促进数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)的定位。为适应物种特异性性状和群体遗传结构的多样性，研究人员开发了一系列定制的BSA方法。在本研究中，研究人员以6份野生稻(Oryza rufipogon)为供体，以优良栽培稻品种优占8号(Youzhan 8，YZ8)为受体，通过杂交和回交构建了BC4F8群体。这6个野生稻渐渗系共同构成了一个嵌套关联作图(Nested Association Mapping，NAM)群体。在对NAM群体中1819个株系的Sd1基因进行基因分型后，研究人员发现携带383 bp缺失的株系中，98.5–99.3%表现为低株高(Low Plant height，LP)表型，而0.7–1.5%表现为高株高(High Plant height，HP)表型。基于此表型分离，研究人员从6个BC4F8群体中分别选取共计20个HP株系和20个LP株系，分别组成H-bulk和L-bulk。利用BSA-seq，研究人员共鉴定出33个显著关联的候选区间。其中一个位于染色体1上的候选区间包含先前报道的调控株高的基因D18。此外，研究人员初步确定了染色体8上的两个主要候选基因组区域(4.60–5.76 Mb和7.29–7.33 Mb)。结合RNA-seq数据、CAFRI-Rice在线功能预测和逆转录定量聚合酶链反应(Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)验证，研究人员筛选出两个关键候选基因LOC_Os08g09900和LOC_Os08g09000用于后续功能表征。本研究结果表明，NAM-BSA技术在检测与复杂性状相关的QTL方面具有巨大潜力，可为水稻复杂性状的遗传剖析提供新的技术策略。
本研究发表于《Plants》。水稻是全球半数以上人口的主食，但长期人工选择导致栽培稻遗传多样性变窄，抗逆性下降。相比之下，野生稻具有高度的遗传多样性和环境适应性，是宝贵的基因库，但其不利的农艺性状增加了基因挖掘难度。传统的双亲连锁分析重组事件有限，定位分辨率低至兆级；全基因组关联分析(GWAS)虽效率高，但易受群体分层和隐秘亲缘关系导致的假阳性影响。嵌套关联作图(NAM)群体作为多亲本群体，兼具高重组率与等位基因多样性，但目前缺乏适配其复杂遗传结构的混池分离分析(BSA)高效定位方法。现有BSA及其衍生技术多局限于双亲群体，极少应用于多亲本群体。株高是影响水稻产量的关键复杂数量性状，除已知的Sd1、D18等基因外，其调控机制尚不完全清楚。为此，研究人员以栽培稻优占8号(YZ8)为轮回亲本，6份野生稻为供体构建NAM群体，开发NAM-BSA方法，旨在挖掘调控株高的未知基因，阐明调控机制并高效利用野生稻种质资源。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法如下。首先构建以YZ8为轮回亲本、6份野生稻为供体的BC4F8 NAM群体（共1819个株系）作为样本队列。其次针对Sd1基因设计引物XianSd1进行基因型分析以筛选表型。接着开发NAM-BSA流程，选取同Sd1基因型的极端株高个体构建高株高混池(H-bulk)与低株高混池(L-bulk)，进行全基因组重测序，采用欧几里得距离(Euclidean Distance，ED)与Δ(SNP-index)两种算法进行关联分析筛选候选区间。随后对极端表型株系进行RNA-seq转录组分析鉴定差异表达基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)，并结合CAFRI-Rice数据库进行功能冗余预测，最后利用RT-qPCR验证候选基因表达模式。
研究结果如下。
NAM群体构建与农艺性状分析。研究人员通过杂交、连续4代回交及6代单粒传构建含6个亚群共1819个株系的NAM群体。农艺性状评价显示株高效应变异系数最高，变幅达84–195 cm，为BSA极端混池构建提供优良材料，聚类分析可将群体分为5个亚群。
NAM群体中Sd1基因的基因型分析。研究人员基于Sd1基因383 bp缺失设计引物XianSd1分型，理论上223 bp产物对应矮秆(≤125 cm)，606 bp对应高秆(>125 cm)。但实际发现携带223 bp缺失的个体中仍有0.7–1.5%表现为高秆，表明株高变异不能完全由Sd1功能缺陷解释，存在其他遗传因素。
NAM-BSA方法的开发。研究人员提出NAM-BSA策略：在同为Sd1缺失基因型(223 bp)的株系中选取20个HP与20个LP个体分别构建混池，利用ED与Δ(SNP-index)两种方法联合分析，将两法均显著的区间定为最优候选区间，阈值分别设为0.08与0.17。
应用NAM-BSA鉴定水稻株高相关基因组区域。研究人员对混池进行Illumina测序，比对日本晴参考基因组后筛选高质量SNP与InDel。ED分析鉴定7个显著区域，Δ(SNP-index)鉴定5个显著区域，两者共同在染色体8上确定两个稳定QTL区间：4.60–5.76 Mb与7.29–7.33 Mb；InDel的ED与Δ(InDel-index)分别鉴定18和6个区域。
候选基因组区域内的基因分析。功能注释在染色体1候选区间发现已知株高基因D18。染色体8的4.60–5.76 Mb区间含180个基因（含转座子、未知功能及表达基因），7.29–7.33 Mb区间仅4个基因（3个逆转录转座子相关，1个表达基因）。
利用RNA-seq进一步分析候选基因。转录组分析鉴定1414个差异表达基因(DEGs)，包括已知株高相关基因OsGA2ox1、OsGA2ox7、OsGA2ox9、OsWRKY53，其在HP中表达显著低于LP。两候选区间内12个DEGs中，10个在HP中高表达，2个萌发样蛋白(germin-like protein)基因LOC_Os08g08970与LOC_Os08g09000在HP中低表达。CAFRI-Rice预测LOC_Os08g09900与OsWRKY53功能冗余。
候选基因表达的RT-qPCR分析。研究人员对6对HP与LP株系进行RT-qPCR，LOC_Os08g09000在所有配对中均在HP中显著下调，与RNA-seq一致；另两个候选基因LOC_Os08g08970与LOC_Os08g09900无一致趋势。
讨论部分总结指出，NAM-BSA整合了NAM群体高遗传分辨率与BSA低成本高效率的优势，无需额外构建分离群体，仅需从既有NAM群体选取极端表型混池即可定位，缩短周期并降低成本和假阳性风险，但受遗传连锁限制分辨率有限且抗干扰弱。研究中利用该方法在Sd1缺失背景下定位33个显著区间，染色体1含D18，染色体8两区间被两算法共验证。结合多组学筛选出LOC_Os08g09900（WRKY家族，与OsWRKY53冗余，HP中低表达）与LOC_Os08g09000（萌发样蛋白，HP中显著下调），后者功能类似已报OsGLP1待证，另提及LOC_Os08g12410（果胶酯酶）也参与细胞壁松弛调控株高值得关注。
结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员以栽培稻YZ8为轮回亲本，与国内外6份野生稻种质杂交回交构建水稻NAM群体。对HP与LP株系采用ED与Δ(SNP-index)两种方法进行BSA关联定位，共鉴定33个显著候选区间，其中染色体1区间含已报株高基因D18。此外，两方法同时在染色体8上检测到两个候选区间(4.60–5.76 Mb和7.29–7.33 Mb)。整合RNA-seq数据、在线功能预测及RT-qPCR验证，筛选出两个关键候选基因LOC_Os08g09900和LOC_Os08g09000用于后续功能表征。本研究建立的NAM-BSA策略融合了多亲本群体与BSA的优点，无需单独开发传统分离群体即可以较低成本进行性状关联定位，可作为水稻复杂农艺性状遗传剖析的有益方法。
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