综述：干燥技术稳定益生菌：工艺、保护策略及活力评估研究进展

《Processes》：Stabilizing Probiotics by Drying: A Review on Processes, Protective Strategies, and Viability Assessment

　　

科学界对益生菌的关注度持续攀升，大量证据表明肠道菌群调控可改善宿主健康。益生菌通常被定义为当摄入充足数量时，能够对宿主产生健康益处的活性微生物。然而，益生菌产品在加工制造、储存及胃肠道转运过程中会面临多重胁迫。其中，干燥作为制备稳定粉末、延长货架期的常用手段，常导致菌体存活率大幅下降。本综述系统梳理了近年来干燥工艺工程、配方设计及活力评估领域的研究进展，旨在提升干燥过程中的菌体存活率。冷冻干燥仍是目前应用最广泛的技术，同时喷雾干燥、真空干燥、喷雾冷冻干燥及静电喷雾干燥等替代技术也正得到日益深入的评估。文中讨论了多种保护策略，涵盖亚致死驯化（胁迫适应）、操作参数优化、辅料添加及微胶囊化。最后，对比了活力评估方法，将平板计数等依赖培养的检测技术与流式细胞术、基于PCR的分子检测等非培养依赖技术进行了比较。但现有研究表明，干燥保护效果具有高度的菌株特异性，工艺优化往往需要在即时存活率、生产周期、粉末稳定性及下游功能性之间进行权衡。

1. 1.
   引言
   人体承载着庞大复杂的微生物群落，即人体微生物组，该生态系统在调控宿主生理、代谢及整体健康中发挥关键作用。菌群失调与多种疾病的发生密切相关，补充足量有益菌（即益生菌）被认为是恢复菌群平衡的策略之一。自1857年巴斯德揭示发酵机制以来，益生菌相关研究不断发展，世界卫生组织（WHO）与联合国粮农组织（FAO）于2001年正式定义益生菌为“摄入充足数量时对宿主产生健康益处的活性微生物”。益生菌应用于食品或药品的前提是经过严格的安全性评价，欧洲食品安全局（EFSA）采用“合格安全推定（QPS）”体系，美国则通过“公认安全（GRAS）”认证进行评估。益生菌需耐受加工（热处理、酸化、混合、长期储存等）、胃肠道环境，并维持精准的剂量与剂型。其功效具有菌株特异性，即使是亲缘关系极近的菌株也无法直接外推研究结果。传统益生菌以乳酸菌（LAB）为主，尤其是乳杆菌属与双歧杆菌属，二者均为革兰氏阳性无芽孢细菌，但在氧耐受性与形态上存在差异。此外，下一代益生菌（如通过宏基因组学筛选的人源菌株）因靶向功能（屏障强化、免疫调节等）受到关注，但该类菌株多为严格厌氧菌，对氧敏感，其干燥稳定化仍需进一步研究，故本综述主要聚焦传统益生菌（尤其是乳杆菌与双歧杆菌）的相关证据。益生菌的健康益处包括促进乳糖消化、调节胃肠功能、免疫调节、改善胆固醇代谢及降低呼吸道与中耳炎相关疾病风险，但证据强度因菌株、研究设计、目标人群及临床终点而异。其生物学效应机制涉及调控宿主防御（免疫与上皮应答）、微生物间竞争抑制、调节宿主或微生物代谢产物（如胆汁盐、毒素、短链脂肪酸）及影响肠道菌群组成与活性。当前益生菌干燥技术、保护配方及活力评估的研究较为分散，缺乏跨技术的直接对比，且活力终点指标（菌落形成单位、流式细胞术计数、膜完整性、代谢活性、存活率等）的不一致增加了结果解读难度。本综述整合相关文献，聚焦干燥技术、保护策略及活力评估，对比不同干燥工艺的优劣，指出知识缺口，讨论工艺效率、细胞存活与储存稳定性间的权衡，明确限制跨研究比较与工业转化的方法学问题。
2. 2.
   综述方法学
   本综述为叙述性综述，旨在批判性整合益生菌干燥技术、保护策略、储存稳定性及活力评估方法的研究进展。文献检索主要依托Google Scholar与Scopus平台，最终结构化检索于2025年12月完成，同行评审修订阶段补充了针对性更新的相关文献。检索策略结合益生菌、干燥技术、配方、稳定性及分析方法相关关键词，包括“probiotic*”与“drying”“freeze drying”“lyophilization”“spray drying”“spray freeze drying”“electrostatic spray drying”“vacuum drying”“fluidized bed drying”“encapsulation”“cryoprotectant”“lyoprotectant”“viability”“survival”“flow cytometry”“plate count”“storage stability”“water activity”“glass transition”“rehydration”“functionality”的组合。纳入标准限定为英文文献，无严格发表时间限制，优先选择近期研究及领域内奠基性经典文献，涵盖原创研究论文、综述、标准、技术文件及监管文件。排除与益生菌无关、未涉及干燥/稳定化/储存/配方/活力评估、仅关注临床疗效而无技术相关性、方法学信息不足的文献。首先筛选标题与摘要的相关性，再对入选文献进行全文评估，手动追溯参考文献以补充来源，使用Zotero管理并剔除重复记录。提取信息包括益生菌菌种/菌株、干燥技术、配方/保护剂、关键工艺参数、存活率结果、残留水分/水分活度（a_w）、储存条件、分析方法及主要优劣势。作为叙述性综述，未进行正式的偏倚风险评估或定量研究质量评分，而是通过考量菌株、配方、工艺条件、分析终点及储存条件的差异，对证据进行批判性解读。
3. 3.
   益生菌生产
   新益生菌菌株的开发需经过分离鉴定、体外及体内功能测试，且功效受环境、剂量及菌株自身特性影响，同物种不同菌株的益生特性可能存在显著差异。从实验室规模到商业化生产的转化是关键阶段，需确保菌株具备足够的胁迫耐受性。工业上主要采用悬浮细胞批式发酵，上游发酵与菌体收获环节直接影响细胞的生理状态，进而决定其对脱水、冷冻、热、氧及渗透胁迫的耐受性。培养基成分不仅影响生物量产量，还调控细胞膜组成、胞内溶质积累及胁迫抗性；接种策略需最小化遗传漂变与生理变异；收获阶段需选择在稳定期末期（通常比指数生长期存活率更高），此时细胞应激机制激活、膜结构适应且保护性胞内化合物积累。发酵温度、pH、搅拌速率、溶氧水平及时长均为关键变量，亚致死胁迫预处理可诱导交叉保护效应。收获与浓缩环节（离心、膜过滤等）需控制剪切力、渗透冲击、氧暴露、温度变化及残留培养基的保护作用，收获后至干燥的间隔时间、温度需严格控制以避免酸化、氧化应激与活力损失。液态制剂稳定性差、货架期短，工业上最终多采用冷冻或干燥稳定化，需添加冷冻保护剂或冻干保护剂，通过调控目标水分活度（a_w）、活菌数、细胞健康状态、分布及货架期性能实现产品标准化。
4. 4.
   干燥技术
   液体菌悬液经干燥转化为粉末可抑制代谢活动、延长货架期，其核心挑战是在抑制代谢的同时避免不可逆细胞损伤，维持储存与复水后的结构完整性与活力。水分活度（a_w）与残留水分含量需协同控制，前者反映游离水的化学反应可用性，后者为总含水量，二者均无法单独预测稳定性，还需考虑胞内水合状态及保护基质的玻璃化转变行为。
   4.1 冷冻干燥（FD）
   冷冻干燥（又称冻干）是目前工业上应用最广的益生菌稳定化技术，通过低温避免热损伤，能有效维持菌体活力、结构完整性与天然形态，复水性优异。但其存在耗时、成本高、致密饼状物需后续粉碎筛分的缺点。传统工艺分为三个阶段：冷冻、初级干燥（升华）与次级干燥（解吸）。冷冻阶段决定冰晶尺寸与孔隙结构，快速冷冻形成小冰晶，慢速冷冻形成大冰晶；大冰晶利于蒸汽流通、缩短干燥时间，但过大冰晶会损伤敏感细胞结构并引发pH偏移，需根据配方优化冷冻速率。初级干燥在真空（通常0.03–0.2 mbar，低于水的三相点6.104 mbar、0.009 °C）下使冰直接升华为水蒸气，加热搁板提供升华潜热，干燥层厚度与孔隙率决定蒸汽流动阻力与干燥时长，需控制升华温度以平衡干燥速率与菌体存活。次级干燥去除非冻结水，通过提高搁板温度（不超过基质塌陷温度与玻璃化转变温度）加速解吸，最终残留水分通常需控制在5%以下，具体目标取决于菌株、保护配方、玻璃化转变特性、包装及储存条件。干燥结束后需立即密封以维持产品状态。
   4.2 真空干燥
   真空干燥设备与冷冻干燥类似，但产品在液态或半液态下通过蒸发去除水分，操作温度与压力更高（通常30–60 mbar），能耗较冷冻干燥低约40%。其优势在于温和的热暴露、低氧接触及较好的活力保留，但处理时间长（约20–100小时），具体取决于配方与操作条件，需严格控制干燥温度与时间以平衡水分活度与菌体存活。
   4.3 喷雾干燥（SD）
   喷雾干燥通过高温雾化液体菌悬液制备粉末，产物呈球形、粒径分布窄、流动性良好，适合工业化连续生产。设备包括进料泵、雾化器、干燥气体源（通常为热空气或氮气）、干燥室及产品分离收集单元。工艺分为雾化、干燥、颗粒分离与收集四个阶段。雾化器类型（离心式、压力式、双流体式、超声式）决定液滴大小与干燥效率；干燥气体与物料的流向配置中，并流模式因湿液滴接触高温气体、干颗粒接触低温气体，可最大限度减少热损伤。 inlet气温通常为150–200 °C，但颗粒温度受蒸发冷却、液滴大小、固含量、气体湿度、停留时间及流场配置共同影响。关键操作参数包括进风温度、出风温度、喷嘴类型与尺寸、气流速率与压力、进料速率，这些参数并非独立作用，需协同调控以平衡热胁迫、脱水胁迫与机械剪切力。喷雾干燥的优势是快速、节能、成本低、易放大，但细胞同时暴露于高温、脱水、剪切力与氧化胁迫，需配合保护策略才能维持终产品功能性。
   4.4 喷雾冷冻干燥（SFD）
   喷雾冷冻干燥结合了喷雾干燥与冷冻干燥的特点，可制备高孔隙率、比表面积大且粒径可调的粉末。其工艺为将液体物料雾化至低温介质（通常为液氮或冷氮气）中瞬间冻结，随后进行冷冻干燥。根据雾化液滴与低温介质的接触方式，分为喷雾冷冻入蒸气相（SFV）、喷雾冷冻入液相（SFL）及喷雾冷冻入气液两相区（SFV/L）三种构型。雾化与冻结阶段决定粉末的物理形态特征，后续干燥阶段决定工艺时间与能耗。该技术兼容连续化生产，热应力低，粉末复水性好，但存在能耗高、周期长、产率低、粉末易吸潮、需无菌操作等局限。
   4.5 静电喷雾干燥（ESD）
   静电喷雾干燥是一种新兴的适用于热敏物质的干燥技术，通过在导电液体进料上施加静电场（通常1–30 kV）实现雾化，可在较低进风温度下完成干燥（益生菌研究中常用70–90 °C），减少热损伤。静电场还可影响液滴内部组分分布，促进水分向表面迁移，改善壳层形成。研究显示，该技术制备的鼠李糖乳杆菌粉末存活率可与冷冻干燥媲美，且储存稳定性更优，兼具连续生产潜力、低氧环境兼容性及挥发性成分保留能力，但设备复杂、成本高，工业应用经验少于冷冻干燥与喷雾干燥，需针对不同菌株与配方开展更多探索。
5. 5.
   干燥过程中的胁迫
   益生菌在干燥过程中面临多重胁迫，细胞可通过合成应激蛋白与修复蛋白、积累保护性溶质进行应对。主要胁迫类型包括：脱水胁迫，水分流失破坏膜、蛋白与酶的结构稳定性，导致胞内成分泄漏与酶活性丧失；渗透胁迫，胞外渗透压升高引发质壁分离，虽可通过积累相容性溶质缓解，但持续胁迫仍会导致活力下降；热与冷冻胁迫，高温致蛋白变性、膜损伤与核酸破坏，低温则降低膜流动性、促进冰晶形成与局部渗透压升高，冷冻干燥中约60%–70%的细胞损伤发生于冷冻阶段；机械/剪切胁迫，喷雾干燥中高压雾化产生的剪切力会降低菌体活力，其影响常与热损伤协同；氧化胁迫，溶解氧与干燥气体中的活性氧（ROS）会攻击膜脂质、蛋白与核酸，严格厌氧的双歧杆菌尤为敏感。不同干燥技术对各胁迫因子的暴露程度存在差异，且干燥后的复水冲击及储存期的湿度、氧气、温度影响也需纳入考量。
6. 6.
   保护策略
   6.1 胁迫适应
   通过发酵过程中亚致死胁迫预处理可激活细胞应激通路，增强后续加工耐受性，该交叉保护效应已被广泛证实。热适应可诱导分子伴侣与蛋白酶，维持蛋白结构与功能；渗透调节促进相容性溶质积累；酸适应优化胞内pH稳态与膜脂肪酸组成；氧化适应增强抗氧化防御能力。其中亚致死热激（40–55 °C处理15–30分钟）应用最广，可显著提升喷雾干燥与冷冻干燥后的存活率，但效果具有菌株特异性，需避免过度处理导致生物量产率下降或亚致死损伤，且需结合配方、干燥工艺、储存稳定性综合评估。
   6.2 工艺参数优化
   工艺优化是提升存活率的首要步骤，需采用质量源于设计（QbD）与实验设计（DoE）方法，针对菌株与干燥技术定制关键参数。冷冻干燥中，冷冻速率需平衡胞内冰晶形成与渗透胁迫，不存在通用最优值；退火步骤（将产品短暂升温至冻结浓缩基质玻璃化转变温度Tg'以上、熔点以下）可促进冰晶粗化、改善升华效率并提升存活率，但需严格控制温度与保温时间。初级干燥中，适当提高搁板温度可缩短干燥时间（约40%）且不降低存活率，前提是产品温度低于基质塌陷温度。喷雾干燥中，进风温度、出风温度、液滴大小（由喷嘴与雾化压力决定）及进料速率共同决定热负荷与干燥动力学，静电喷雾干燥可通过降低干燥温度减轻热胁迫；较低的雾化压力可减少剪切力损伤，但需兼顾液滴干燥程度与终产品残留水分对储存稳定性的影响。
   6.3 保护物质添加
   添加糖类、蛋白、多元醇、胶类等辅料是最常用的保护策略，其作用机制包括玻璃化理论（形成高黏度玻璃态基质固定细胞结构）、水替代假说（糖羟基替代膜磷脂与蛋白结合的水分子）、水合作用力假说（维持脱水状态下膜头基间距），还可清除活性氧、模拟胁迫响应、调控干燥动力学。低分子量保护剂（海藻糖、蔗糖、乳糖、山梨醇等）易玻璃化并与膜形成氢键；高分子量保护剂（乳蛋白、明胶、菊粉、多糖等）形成黏性表层，减少机械与氧化损伤。辅料可分为稳定剂（蔗糖、海藻糖等，维持蛋白结构）、填充剂（甘露醇、甘氨酸等，改善物理结构）、表面活性剂（聚山梨酯等，降低界面应力）与缓冲剂（维持pH稳定）。碳水化合物（尤其是二糖）是研究最多的类别，常与蛋白或多糖复配产生协同效应，如蔗糖与胶束酪蛋白联用可显著提升存活率，复合配方的优化需借助响应面法等统计工具，且效果高度依赖菌株与工艺。
   6.4 微胶囊化
   微胶囊化通过物理屏障保护菌体免受低pH、胆盐、氧、冷冻与热胁迫，需区分微囊化（细胞包埋于离散颗粒）、基质嵌入（细胞分散于连续基质）、包衣（颗粒外覆层）与固定化（细胞滞留于载体）的概念。壁材分为天然基质（多糖如海藻酸钠、κ-卡拉胶、阿拉伯胶、结冷胶、黄原胶、果胶、壳聚糖；蛋白如明胶、乳蛋白、植物蛋白）与合成基质（PLA、PGA、PEG、PVA等，多用于医药领域）。保护机制除物理屏障外，还包括基质介导的渐进脱水、水替代、氢键结合与玻璃化稳定作用。常用技术包括干燥法（喷雾干燥、静电喷雾干燥、冷冻干燥、喷雾冷冻干燥）、挤出法、乳化/内凝胶法、离子凝胶法、复合凝聚法等。性能评价指标需区分包封率（初始细胞中被成功包埋的比例）、细胞回收率（处理后存活细胞数）、干燥得率（回收干重占进料干重比例）及存活率（特定胁迫后保留的活细胞比例）。粒径是关键参数，100–200 μm为兼顾保护作用与产品适用性的较优范围。微胶囊化可提升干燥与储存存活率，实现胃肠道靶向释放，但会增加成本与工艺复杂度，需平衡保护效果与细胞释放性能、感官影响及法规合规性。
7. 7.
   干燥后稳定性、货架期与复水性能
   干燥后的储存稳定性是工业应用的核心指标，高即时存活率并不等同于长期稳定性，储存期间细胞可能逐渐丧失培养能力、膜完整性、代谢活性及菌株特异性功能。影响因素包括储存温度、水分活度、残留水分、氧暴露与包装性能。储存温度需低于保护基质的玻璃化转变温度（Tg）以降低分子流动性；水分活度与残留水分需协同控制，过度干燥会破坏维持膜与蛋白结构所需的最小水合层，水分过高则会塑化基质、降低Tg、加速降解反应，还可能引发无定形粉末的结晶、结块等物理变化；包装需阻隔水汽与氧气，配合充氮、真空、吸氧剂与干燥剂使用。不同干燥技术制备的粉末结构（孔隙率、团聚体大小）会影响储存稳定性，如流化床干燥所得低孔隙率、小团聚体粉末的水分吸附率更低。货架期评估需区分实时稳定性研究与加速稳定性研究，后者可用于配方初筛，但无法完全替代实时研究以确定实际货架期与所需过量投料量。复水是另一关键环节，不当的复水条件（渗透压冲击、复水介质组成、温度、速率等）会导致细胞损伤，在复水介质中添加糖、盐与非蛋白氮化合物可提升模拟胃肠道条件下的存活率与黏附等功能特性，因此终产品评估需包含复水后细胞的生理功能恢复情况。
8. 8.
   活力评估
   益生菌产品的健康效益依赖于足量的活菌，活力评估是质量控制与工艺优化的核心。需明确区分不同终点：活力为广义的存活与潜在功能能力；培养能力特指在选定条件下形成菌落的能力（平板计数法测定）；生理活性指代谢、酶活性、膜电位等生理状态；膜完整性指细胞质膜的完好性；代谢活性指酯酶活性、产酸能力、呼吸作用等生化功能；益生菌功能性指菌株发挥预期健康效应的能力，无法仅通过活力推断。样品前处理（复水介质、温度、时长、渗透压、氧暴露、混合强度、细胞解聚等）会显著影响检测结果，需标准化并详细报告。
   分析方法分为培养依赖法与非培养依赖法两类。培养依赖法以菌落形成单位（CFU）为终点，包括平板计数法（倾注平板法与涂布平板法）、最大概率数法、生长曲线分析、产酸速率测定、等温微量热法与直接活菌计数法。其中平板计数是行业金标准，但耗时长（>72小时）、通量低、精度有限（误差可达35%），且无法检测活的不可培养（VBNC）状态细胞，不适用于复杂益生菌复方产品或过程监控。
   非培养依赖法从膜完整性、代谢活性或核酸信号等角度评估活力，主要包括三类：流式细胞术（FC），通过荧光染料（碘化丙啶PI、SYTO 9、羧基荧光素二乙酸酯cFDA等）标记，结合前向散射与侧向散射信号，实现单细胞水平的活/损伤/死亚群区分，ISO 19344（IDF 232:2015）已将其标准化用于发酵产品中乳酸菌与益生菌的计数，阻抗流式细胞术（IFC）作为新兴技术，通过测量细胞穿越微流控通道时的频率依赖性电阻抗，可提供尺寸、膜完整性等多参数信息，与荧光流式细胞术结果一致性良好。分子检测方法，以PCR为基础，实时荧光定量PCR（qPCR）通过荧光信号实时监测扩增过程，以量化循环数（Cq）定量靶标，数字PCR（dPCR）通过将反应体系分区至数千个纳升级微腔，基于泊松统计实现绝对定量，无需标准曲线；但DNA无法区分活/死细胞，需联合光活化染料（如叠氮丙锭PMA、溴乙锭单氮化物EMA）的 viability PCR（vPCR）技术，选择性扩增膜完整细胞的核酸。其他方法中，单细胞拉曼光谱（SCRS）通过内源性生化指纹无标记表征细胞代谢状态与活力，结合稳定同位素探针（如D₂O、¹³C、¹⁵N）可追踪代谢活性，联用单细胞基因组测序的SCIVVS框架可实现益生菌的单细胞鉴定、活力、生理活性与测序一体化分析，但该技术仍需进一步验证与数据库标准化。不同方法测量终点各异，需根据产品类型、生产阶段、分析目的与设备条件选择或组合使用。
9. 9.
   结论
   干燥是决定益生菌产品性能的关键环节，其在实现货架稳定的同时可能造成显著活力损失，存活率是配方、工艺与菌株共同作用的结果，而非单一因素决定。冷冻干燥仍是主流技术，但周期长、能耗高、批次操作；喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、静电喷雾干燥等在工艺参数与配方优化得当的前提下，可达到与冷冻干燥相当的存活率，并在处理时间、连续性、放大性与颗粒工程方面具备优势。提升存活率的四大互补策略为：胁迫适应预激活保护响应；辅料（尤其是糖类，常与蛋白或多糖复配）通过玻璃化、水替代与界面保护稳定膜与蛋白结构；微胶囊化提供物理屏障并实现靶向释放；工艺优化（冷冻干燥中的冷冻曲线与退火、喷雾干燥中的温度/停留时间/雾化窗口等）需针对菌株特性定制，平衡即时存活率、生产周期、残留水分与下游功能。活力评估需结合培养依赖与非培养依赖技术，减少亚致死损伤的评估偏差，未来需统一分析方法与活力指标以提升研究可比性。干燥后稳定性与复水性能应纳入产品设计全流程，通过实时与加速稳定性研究、降解动力学分析与过量投料设计，确保货架期内维持目标活菌量与功能特性。益生菌干燥稳定化无通用方案，需将菌株定制化配方与工艺窗口相结合，未来通过整合工艺工程、配方科学与先进活力分析技术，有望开发出规模化、高稳定性、临床可靠的益生菌产品。