《Bioelectrochemistry》：A multi-well axon array device for evaluation of stimulus responses on human sensory neural spheroid-derived axon fascicles
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理解涉及疼痛感知的感觉神经元对外部刺激的反应对于开发慢性疼痛治疗和确定疼痛阈值至关重要。在药物发现领域，源自人诱导多能干细胞（hiPSC）的培养神经元被用于评估疼痛感知。近年来，已构建出源自hiPSC衍生感觉神经球的三维轴突组织。这些三维轴突组织可以模拟外周神
理解涉及疼痛感知的感觉神经元对外部刺激的反应对于开发慢性疼痛治疗和确定疼痛阈值至关重要。在药物发现领域，源自人诱导多能干细胞（hiPSC）的培养神经元被用于评估疼痛感知。近年来，已构建出源自hiPSC衍生感觉神经球的三维轴突组织。这些三维轴突组织可以模拟外周神经系统中发现的轴突束（AFs），使这些组织有望用于旨在克服种间差异的细胞实验。然而，针对AF功能进行的物理和药理刺激反应评估尚不充分。在此，研究人员开发了一种用于hiPSC衍生感觉神经球的多孔轴突阵列（MAA）装置，该装置包含四个AFs，并同时评估了这些轴突束中的各种刺激反应。利用MAA装置，研究人员评估了在轴突束功能发育过程中自发活动的时间变化，以及针对伤害感受器的热刺激和药理刺激反应。研究人员还确认了MAA装置允许对AFs内的局部区域进行电刺激，并检测到刺激诱发的反应。这些发现表明，MAA装置对于评估AFs的刺激诱发反应特性是有效的。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
疼痛是一种有害的生理反应，慢性疼痛对生活质量有显著的负面影响。研究人员通过涉及人类、实验动物和培养细胞的各种实验方法，致力于阐明疼痛产生的机制，旨在开发缓解慢性疼痛的新药和减少疼痛的治疗方法。建立定量评估疼痛感觉的方法学是研究疼痛产生机制的关键途径。然而，在通过问卷等方法进行的心理物理疼痛评估中，感知阈值存在显著的个体差异。此外，还需要对个体和种族差异的影响进行广泛研究。同时，具有伤害感受器的神经纤维较细，并且在感知负责的感觉神经细胞做出反应后，它们才对外部刺激做出反应。具体而言，两种类型的细神经纤维，Aδ纤维和C纤维，据报道在疼痛感知中发挥作用。这些纤维表现出的不同反应使人类受试者实验中观察到的特定反应的评估变得复杂。在此，背根神经节（DRG）常被用作评估疼痛感知机制的目标区域。然而，在采用DRG的疼痛研究领域，主要使用来自实验动物（如大鼠和小鼠）的原代培养细胞。但基于细胞分析的早期研究报告称，人类和啮齿动物DRG神经元中离子通道和受体的表达模式及功能存在差异。此外，人类DRG神经元中存在的基因只在啮齿动物的某些神经元亚型中发现。一些镇痛药物可能带来意想不到的副作用风险。这些观察结果强调了必须考虑人类与动物之间实验种间差异的影响。
近年来，已经开发了许多评估系统，旨在利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的感觉神经元进行疼痛评估。此外，研究已致力于开发三维神经纤维结构，以模拟从人iPSC来源神经元在体内观察到的束状轴突。这些方法已经形成了以束状轴突为特征的神经组织，称为人感觉神经类器官。鉴于人类外周神经系统结构由轴突束（AFs）组成的解剖学发现，利用从人感觉神经球（hSNS）形成的束状轴突来评估神经元反应是合适的。然而，很少有研究评估源自hSNS的AFs对与疼痛感知相关的伤害性刺激的反应。
为了评估轴突中的刺激反应，以往的研究使用集成微电极阵列（MEA）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置的设备来估计沿轴突传播的动作电位传导速度（CV）。使用MEA进行细胞外电位记录具有非侵入性地长时间测量沿轴突传播的动作电位的优势，这使其成为需要高时空分辨率测量（如CV）的评估中极其有效的方法。此外，MEA系统内置的电刺激功能便于进行细致的参数配置，包括电流值、脉冲宽度和刺激间隔等参数。事实上，已开发了一种基于新型高密度MEA（HD-MEA）的体外平台，用于研究对电刺激的反应和神经性疼痛的潜在机制。然而，尚未开发出一个集成平台，该平台聚焦于具有三维结构和大直径（>50 μm）的高密度轴突的形成，以及评估刺激反应，如电刺激在AFs中诱发的复合神经动作电位（CNAPs）。
**研究目标与意义**
在这项研究中，研究人员开发了一种多孔轴突阵列（MAA）装置，用于评估对外部刺激做出反应的疼痛感知机制。该MAA装置包含一个新设计的MEA和一个专门为hSNS设计的PDMS腔室，可以使用市售的64通道MEA系统进行评估。研究人员展示了使用MAA装置和hSNS以高精度和高效率评估AFs对外部刺激反应的结果。所提出的MAA装置有潜力应用于使用各种疼痛相关hSNS的研究，以评估AFs中的CNAPs、对电刺激的反应阈值差异以及刺激反应的潜在机制。该论文发表在《Bioelectrochemistry》。
**主要技术方法**
研究人员开发了一种多孔轴突阵列（MAA）装置，该装置由定制设计的微电极阵列（MEA）探针和聚二甲基硅氧烷（PDMS）腔室组成。MEA探针包含四行平行排列的电极，每行16个电极，用于电生理记录和刺激。PDMS腔室设计了微流控隧道，用于引导人感觉神经球（hSNS）来源的轴突束（AFs）在MEA电极上形成。hSNS由商业来源（Axol Bioscience, UK）的人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的感觉神经元祖细胞分化而来。研究人员利用该装置进行细胞外电位记录，评估自发活动，并实施热刺激、药理刺激（辣椒素）和电刺激，以检测AFs的刺激反应。
**研究结果**
**3.1. MAA装置中AFs的发育**
通过将hSNS接种到MAA装置的PDMS腔室中，观察到轴突在1周内侵入微流控隧道，并在2-3周内形成覆盖MEA电极的AFs。免疫组织化学染色证实hSNS富含外周神经细胞，且形成轴突束的轴突主要为PRPH阳性的C纤维。使用NeuO染色证实了微流控隧道中AFs的长期存活。通过MEA评估自发活动，发现不同AFs的尖峰频率模式存在差异，且随着培养时间的延长，起点和终点电极检测到的尖峰频率趋于相似，表明AFs的成熟。
**3.2. 使用MAA装置评估热和药理反应**
通过向培养基中添加70°C的培养基使温度升至>45°C，观察到所有AFs的尖峰频率显著增加，证实了热刺激反应。在添加含辣椒素（TRPV1激动剂）的培养基后，观察到尖峰频率急剧增加，而对照组（添加溶剂乙醇）无显著变化，证明了药理刺激反应。这些反应在所有电极上均可检测到，表明MAA装置能有效评估伤害感受器功能。
**3.3. 使用MAA装置评估轴突传导速度（CV）**
通过施加双极脉冲电刺激，研究人员测量了AFs中动作电位的传导速度（CV）。在27-39°C温度范围内，CV范围为1.06±0.22至1.78±0.24 m/s，与人无髓鞘C纤维的CV（0.5-2.0 m/s）一致。CV随温度升高而增加，每2°C升高约10%，与既往研究相符。
**3.4. 使用MAA装置评估电刺激响应**
研究人员评估了不同发育阶段（早期和成熟期）AFs对电刺激的反应。结果显示，随着刺激电流强度的增加，刺激诱发的复合神经动作电位（CNAP）样反应幅度呈阶梯式增加并趋于饱和。成熟期AFs的反应幅度更大，且达到饱和所需的刺激电流更高。脉冲宽度越长，饱和阈值电流越低，这与电刺激强度-持续时间关系一致。该研究还发现，刺激电极与记录电极之间的距离影响反应幅度，当距离达到7-8个电极间距时，幅度趋于稳定。
**讨论与结论**
本研究开发的MAA装置能够形成和评估多个AFs，用于评估参与疼痛感知的感觉神经。研究人员通过评估hSNS形成过程中的自发活动，确认了沿AFs传播的尖峰频率在培养期间的变化。即使在不同的hSNS中，这些自发活动也对高温热刺激和药理刺激（如辣椒素）表现出可识别的反应，表明该装置能评估伤害感受器的存在和功能。此外，MAA装置可用于评估AFs中动作电位的传导速度（CV）以及对电刺激的阈值检测。测得的CV（0.5-2.0 m/s）与体内观察结果高度一致。电刺激诱发的CNAP样反应阈值存在差异，可能源于AFs厚度和轴突数量的不同。随着脉冲宽度增加，刺激阈值降低，支持了MAA装置用于研究AFs中刺激阈值脉冲宽度依赖变化的有效性。然而，本研究未调查使用MAA装置时细胞类型特异性反应的影响。特别是，特定细胞类型的特性可能导致其对电刺激的反应、AFs的功能成熟以及热和药理反应方面的显著差异。因此，需要通过这些研究建立更优化的方案来评估疼痛感知机制和阈值。本研究中开发的平台有望用于评估此类细胞类型特异性特征。长期目标是构建装置内的有髓神经纤维，以更接近人体感觉系统。此外，使用该装置评估疼痛相关反应时，必须全面了解所用细胞群体的特征，包括感觉神经元亚型、离子通道功能、单根AFs的轴突分布以及功能形态差异对刺激反应和传导速度的影响。稳定细胞群体对于提高结果的可重复性至关重要。
**结论部分翻译**
在这项研究中，研究人员开发了一种MAA装置，能够形成和评估多个AFs，以评估参与疼痛感知的感觉神经。研究人员使用MAA装置评估了hSNS形成过程中的自发活动，并确认了沿AFs传播的尖峰频率在培养期间的变化。研究人员证明了这些自发活动，即使在不同的hSNS中，也对高温热刺激和药理刺激（如辣椒素）表现出可识别的反应。这一结果表明，所开发的MAA装置可以评估伤害感受器的存在和功能。此外，当连接到MAA装置时，MEA电极可以利用任意两个点作为电刺激电极。同时，本研究评估了沿AFs传播的动作电位的CV，以及通过电刺激检测刺激诱发反应阈值的性能。测得的CV范围为0.5到2.0 m/s，与体内观察结果高度吻合。此外，观察到电刺激诱发的CNAP样反应阈值存在差异，这可能是由于AFs厚度和轴突数量的变化所致。随着脉冲宽度增加，刺激阈值降低，这支持了MAA装置用于研究AFs中刺激阈值脉冲宽度依赖变化的有效性。然而，本研究未调查使用MAA装置时细胞类型特异性反应的影响。特别是，特定细胞类型的特性可能导致其对电刺激的反应、AFs的功能成熟以及热和药理反应方面的显著差异。因此，需要通过这些研究建立更优化的方案来评估疼痛感知机制和阈值。本研究中开发的平台有望用于评估此类细胞类型特异性特征。具体而言，外周神经系统含有与疼痛感知相关的有髓轴突，称为Aδ纤维，这些轴突被施万细胞形成的髓鞘包围。本研究的初步实验侧重于无髓神经纤维的利用；因此，长期目标是在装置内构建有髓神经纤维，以更接近人体感觉系统。此外，在使用该装置评估疼痛相关反应时，必须全面了解本研究中使用的细胞群体的特征。这包括样品中存在的感觉神经元亚型、AFs中各种离子通道的功能评估、构成单根AFs的轴突分布，以及功能和形态差异对刺激反应和传导速度的影响。此外，稳定细胞群体对于提高结果的可重复性至关重要。
