《Biotechnology Advances》：Microbial single-cell sequencing technologies: Principles, applications, and spatial integration
单细胞测序解析了微生物异质性，超越了传统的宏组学方法。Split-pool barcoding, FACS 和 droplet microfluidics 满足了多样化的分离需求。微生物单细胞RNA测序(scRNA-seq)揭示了转录多样性和动态细胞状态。微生物单细胞DNA测序(scDNA-seq)实现了菌株水平基因组恢复和稀有变异检测。空间组学整合了测序和荧光原位杂交(FISH)技术，以原位绘制微生物群落图谱。
1. 引言
微生物群落在全球生态系统中驱动着碳循环、土壤养分转化等关键生物地球化学过程，并在人类健康中影响免疫、代谢和疾病易感性。传统检测方法从培养依赖技术发展到分子技术，如16S rRNA测序，但扩增子方法分辨率有限，宏基因组测序难以解析菌株水平异质性。研究人员认识到这些局限性，推动了单细胞测序技术的发展，以解析细胞异质性、检测稀有种群。早期真核单细胞RNA测序(scRNA-seq)取得成功后，微生物应用面临细胞小、细胞壁多样、RNA加工机制独特等挑战。关键方法学基础包括MATQ-seq，随后扩展到细菌领域，实现了首个单细菌转录组分析。后续microSPLiT和PETRI-seq等突破实现了微生物单细胞转录组学，同时微生物单细胞基因组学也取得进展，如SiC-seq实现高通量基因组测序。本综述系统总结了微生物单细胞测序技术的分离方法、转录组平台、基因组技术和新兴空间多组学技术，阐明技术原理、比较优势及生物学应用，并评估当前局限和未来前景。
2. 微生物单细胞分离方法
有效的微生物单细胞分离决定了下游分析质量，但实现精确分离同时防止交叉污染仍具挑战。微生物细胞具有小尺寸、多样细胞壁和聚集现象。三种主要策略包括split-pool barcoding、荧光激活细胞分选(FACS)和液滴微流控。
2.1 Split-pool barcoding: 可扩展且设备轻量
Split-pool barcoding是一种高通量单细胞标记方法，不依赖物理分离，而是通过多轮随机分配和组合标记为每个细胞赋予独特条形码组合。核心流程包括细胞固定与透化、多轮“split-pool-ligation”、以及最终文库构建。PETRI-seq和microSPLiT将该策略扩展到微生物，但存在高核糖体RNA(rRNA)污染问题，后续RiboD-PETRI-seq和BaSSSh-seq优化了rRNA去除效率。该技术优势在于仅需标准实验室设备且可扩展性强，但应用受限：适合细胞数充足的样本，对细胞物理化学完整性要求高，多步操作易导致细胞破裂或损失；物种兼容性窄，固定和透化条件需针对不同物种优化；单细胞分辨率依赖于细胞在孔中的物理分离，环境样本中细菌聚集可能导致假嵌合数据；多轮split-pool过程中洗涤不充分可能引起条形码错标。需严格质量控制防止细胞聚集，计算分析也较复杂。
2.2 FACS: 精准分选与表型选择
FACS是一种基于流式细胞术的技术，通过流体动力学聚焦使细胞形成单列流，利用荧光标记分析并分选细胞。该方法确保高纯度，允许基于特定细胞特征进行靶向选择。MATQ-seq和RamDA-seq等成功整合了FACS与单细胞转录组学，Homberger等进一步引入自动化流程和基于Cas9的rRNA去除。FACS也适用于单细胞基因组学，可从复杂样本中分离单个微生物细胞，并能与多种分子标记技术整合，适合低输入样本。但FACS处理复杂样本或未培养细菌时面临挑战：依赖荧光标记区分靶细胞，而开发细菌特异性标记需先验表面抗原知识；新兴成像流式细胞术(IFC)部分克服了标记依赖。样本条件显著影响分选结果，脆弱细胞可能在高压力下破裂；环境DNA和试剂污染会混淆下游分析；常用的MDA方法存在扩增偏好，导致基因组覆盖不均。
2.3 液滴微流控：高通量封装
液滴微流控利用精确流体操控将单个微生物细胞与试剂封装在不混溶油相中的水相液滴内，液滴作为隔离微反应器防止交叉污染，实现高通量并行处理。定制化平台如BacDrop、M3-seq、ProBac-seq、smGel-seq和smRandom-seq变体成功将高通量单细胞测序扩展到微生物领域。这些装置产生单分散液滴(20–100 μm)，封装速率达10,000–100,000液滴/分钟，单细胞捕获效率约5–15%。相比FACS，液滴微流控具有更高通量、更少试剂消耗和简化操作。但微生物细胞壁差异大，难以建立通用裂解方案；下游流程复杂，需专业技术；对缺乏高质量参考基因组的未培养微生物，短读长测序数据的比对和组装面临困难。选择技术需平衡通量、预算、样本特性和分析目标。
3. 微生物单细胞RNA测序技术及其应用进展
微生物scRNA-seq面临独特挑战：细胞小、细胞壁多样、原核mRNA通常缺乏poly(A)尾且被大量rRNA遮蔽。为解决这些瓶颈，涌现了一系列创新解决方案。
3.1 rRNA去除策略
3.1.1 基于探针的RNase H介导去除
该策略利用RNase H特异性切割RNA-DNA杂交体中的RNA。DNA探针与保守rRNA序列互补形成杂合双链，RNase H选择性降解rRNA，DNase处理去除残留探针。验证显示rRNA映射读段从94.0%降至26.5%，非rRNA读段富集平均13.0倍。BacDrop和M3-seq采用该方法，但RNase H可能非特异性切割单链RNA或DNA，影响非rRNA转录本丰度；反应条件需精确优化；预设计探针限制了对无参考基因组微生物的应用。
3.1.2 基于CRISPR-Cas9的rRNA去除
该方法利用可编程核酸酶(Cas9)与单引导RNA(sgRNA)靶向rRNA编码序列，切割文库中rRNA来源的cDNA片段，去除后富集非rRNA序列。DASH方法实验验证显示rRNA含量降低30–50%。改进版MATQ-seq和RamDA-seq整合了该协议，mRNA读段超过总读段30%。smRandom-seq和smRandom-seq2也采用该策略，将大肠杆菌rRNA比例从83%降至32%。DASH步骤完全在cDNA文库水平进行，避免RNA降解风险；sgRNA可针对任何高丰度序列设计，具有广泛物种适用性。但sgRNA设计复杂，去除效率可能不及RNase H方法，且需精确控制反应条件。
3.1.3 基于生物素标记探针和链霉亲和素磁珠的rRNA去除
该方法使用生物素修饰探针识别rRNA来源的cDNA，通过链霉亲和素包被磁珠捕获并去除核糖体cDNA。RiboD-PETRI-seq和BaSSSh-seq采用该策略。RiboD技术显著减少rRNA干扰，实现92% mRNA检测率。BaSSSh-seq采用无酶减法杂交去除，将rRNA含量降至50%以下，通过消除酶促步骤进一步减少细胞损失。
3.2 解决细菌mRNA捕获挑战
细菌mRNA缺乏poly(A)尾，无法使用oligo(dT)引物，需特殊捕获策略。
3.2.1 基于随机引物的方法
随机引物可非特异性杂交多种RNA分子，提高检测灵敏度，但非选择性结合导致rRNA过度捕获，常使rRNA占测序读段90%以上。“Not-So-Random primers”(NSRs)排除rRNA互补序列，改善mRNA特异性捕获。
3.2.2 末端加尾策略
MATQ-seq利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)向cDNA 3'端添加dC尾，与富含G的MALBAC引物互补配对。smRandom-seq使用TdT添加poly(dA)尾，然后用poly(dT)磁珠捕获。microSPLiT使用poly(A)聚合酶(PAP)进行加尾，mRNA富集提高约2.5倍。这些方法有效桥接了细菌和真核mRNA捕获方法。
3.2.3 互补策略
ProBac-seq采用定制设计探针，靶向已验证的基因特异性序列，但依赖先验基因组信息。Microcolony-seq将单细菌扩展为微菌落，通过bulk RNA-seq推断祖先细胞表型状态，但通量低且限于可培养生物。此外，细菌mRNA半衰期短，转录组快照捕获瞬时波动；链状和聚集形态对细胞分选构成挑战；化学固定虽可捕获瞬时转录状态，但显著降低后续原位酶促反应效率，需优化反应条件。
3.3 微生物scRNA-seq数据分析与应用
3.3.1 数据分析流程
微生物scRNA-seq数据分析流程包括三个阶段：基础数据处理（质量控制、比对、UMI去重，使用FastQC、Cutadapt、STAR、Bowtie 2、UMI-tools等工具，缺乏参考基因组时使用mKmer等无参考策略）；细胞群体识别（严格质量过滤、降维与可视化如PCA和UMAP、聚类如Louvain/Leiden算法）；深层生物学机制提取（轨迹推断、RNA速度、基因调控网络重建）。研究人员开发了专用MscT框架整合定制质量控制指标。
3.3.2 生物学应用与发现
3.3.2.1 亚群鉴定与表征
M3-seq在大肠杆菌中鉴定出表达gadA/gadB基因的耐酸亚群，支持“bet-hedging”模型。BacDrop在肺炎克雷伯菌中检测到高表达移动遗传元件(MGEs)的稀有亚群。microSPLiT在枯草芽孢杆菌中发现异源激活肌醇分解的亚群。Microcolony-seq鉴别出肠致病性大肠杆菌(EPEC)的毒力(VirEPEC)和非毒力(AvirEPEC)状态，AvirEPEC表现出增强运动性和高盐适应能力。
3.3.2.2 稀有种群发现
M3-seq在抑菌抗生素处理下鉴定出表达MGEs和冷休克反应基因的稀有大肠杆菌亚群。microSPLiT在枯草芽孢杆菌中检测到高表达PBSX前噬菌体基因的稀有亚群。
3.3.2.3 代谢异质性
牛瘤胃微生物组中Succinivibrio亚群表现出代谢分歧：整合酶表达细胞上调琥珀酸途径，甲酸/亚硝酸盐转运蛋白表达细胞上调乙酰辅酶A途径。smGel-seq分析痰液样本鉴定出鲍曼不动杆菌两个亚群，分别与硫/氮代谢和膜蛋白/核糖体合成/毒力/抗生素抗性基因(ARGs)相关。牙周炎条件下，共生菌Neisseria elongata发生功能失活。但转录异质性应解释为潜在而非实际代谢异质性，需正交验证。
3.3.2.4 噬菌体-宿主相互作用网络
smRandom-seq2在人类肠道微生物组中鉴定出至少325个稳健宿主-噬菌体相互作用，前噬菌体携带的功能基因参与关键代谢通路。与传统bulk测序相比，该方法在解析真实宿主-噬菌体关联方面具有更高灵敏度和特异性。
4. 用于基因组研究的新型微生物单细胞DNA测序技术
微生物单细胞DNA测序(scDNA-seq)克服了宏基因组测序的固有局限，如基因组组装碎片化和无法解析细胞异质性。自2007年Stepanauskas将FACS与MDA结合用于单海洋细菌测序以来，技术经历了显著演进。MDA存在扩增偏好和嵌合体问题，替代线性扩增技术如MALBAC和LIANTI被开发。研究人员整合微流控推进该领域，包括SiC-seq、SAG-gel、PMA-SAG-gel、Microbe-seq、DoTA-seq、EASi-seq和Bead-split-pool方法。近期突破包括Microcolony-seq和半透性胶囊(SPC)技术。
4.1 技术演进与当前平台
4.1.1 早期液滴方法
SiC-seq将细胞封装在琼脂糖液滴中，进行液滴内裂解和条形码PCR扩增，但存在基因组覆盖不全和假阳性问题。
4.1.2 增强型凝胶系统
SAG-gel通过改进琼脂糖凝胶封装系统，结合酶裂解和MDA扩增，提高基因组覆盖度和处理效率。scMicrobe-PTA利用初级模板定向扩增(PTA)实现“准线性”扩增，将基因组覆盖度从30%提升至81%。
4.1.3 活细胞靶向
PMA-SAG-gel引入叠氮溴化丙锭(PMA)预处理，选择性穿透受损细胞膜并交联DNA，特异性靶向活细胞。
4.1.4 先进高通量平台
Microbe-seq采用液滴微流控封装单个细胞，进行裂解、全基因组扩增、片段化和接头连接，但需要复杂微流控设备。GSE-Seq强调广泛适用性和长读长测序兼容性，将细胞封装在可降解水凝胶基质中，使用PacBio平台测序。
4.1.5 与现有商业平台整合
EASi-seq引入“即插即用”工作流，使用商业Tapestri液滴系统，无需定制微流控芯片，在2–3小时内生成数万个细胞条形码读段。
4.1.6 靶向单细胞基因组学
DoTA-seq采用丙烯酰胺凝胶封装策略，保留基因组和质粒DNA，允许裂解试剂自由扩散，实现多重靶向扩增，适用于抗生素抗性基因(ARGs)和遗传变异研究。
4.1.7 Split-pool barcoding策略
聚丙烯酰胺微珠池条形码方法采用split-pool barcoding实现成本效益可扩展性，适合资源受限实验室。
4.2 微生物scDNA-seq数据分析与应用
4.2.1 数据分析流程
流程包括质量控制（FastQC、Trimmomatic）、比对（BWA、Bowtie 2）或从头组装（SPAdes、IDBA-UD），使用CheckM评估完整度，Prokka或Bakta进行功能注释。遗传变异检测（SNV、Indel、结构变异）使用GATK for Microbes、FreeBayes等，专用校正算法如SCIΦ或Monovar区分真实变异与扩增错误。最终进行系统发育树构建（RAxML、IQ-TREE）和功能富集分析（KEGG、eggNOG-mapper）。
4.2.2 基因组应用与发现
4.2.2.1 物种水平基因组组装与质量评估
Microbe-seq获得21,914个单扩增基因组(SAGs)，组装76个物种水平基因组。SAG-gel从环境样本中获得16个高质量和244个中等质量SAGs。EASi-seq从单个粪便样本中鉴定出1118个高质量单细胞条形码组，构建含95个细菌属的“肠道细胞图谱”。GSE-Seq回收23,266个SAGs。
4.2.2.2 水平基因转移与进化动态
Microbe-seq分析鉴定出49个细菌物种间的66个水平基因转移(HGT)事件，50%转移基因分布在三个或更多物种中。DoTA-seq揭示Desulfovibrionaceae和Bifidobacteriaceae之间共享质粒复制子1351，表明跨门质粒兼容性和转移。
4.2.2.3 新型微生物菌株发现
Microbe-seq通过比较单细胞组装基因组与培养参考基因组，鉴定并完整重建了新型菌株“strain B”。
4.2.2.4 噬菌体-宿主相互作用网络
Microbe-seq共封装细菌和噬菌体，实现直接关联分析，鉴定出crAssphage与Bacteroides vulgatus菌株的显著关联。活性污泥样本研究鉴定出184个宿主-噬菌体关系，部分噬菌体携带ARGs。GSE-Seq从单个粪便样本中鉴定出1494个高质量前噬菌体-宿主对。
5. 用于生物发现的创新微生物空间多组学
微生物空间组织决定群落功能、物种相互作用和环境适应。传统单细胞测序方法在样本处理过程中丢失空间信息。微生物空间组学通过保留空间位置同时实现分子剖析，包括杂交基础和测序基础两种策略。
5.1 杂交基础空间技术
CLASI-FISH最早实现微生物空间映射，结合探针标记和荧光显微镜，在人类牙菌斑中区分15个分类群。HiPR-FISH通过先进探针编码策略增强多重能力。Par-seqFISH采用顺序两步杂交，实现单细菌分辨率的空间多基因表达谱。SEER-FISH通过迭代探针杂交和解离结合纠错编码，26轮杂交后荧光信号仍高于背景。Bacterial-MERFISH整合膨胀显微镜、多重FISH和纠错编码，实现纳米级空间分辨率(≤100 nm)和精确基因表达谱。但膨胀显微镜存在细菌细胞壁抵抗均匀膨胀、RNA捕获效率低、酶解步骤可能导致RNA丢失等问题。
5.2 测序基础空间技术
MaPS-seq结合物理样本切片和分子条形码，通过16S rRNA扩增子分析实现微米级空间分辨率。SAMPL-seq引入原位split-merge条形码标记，提高检测效率。RAINBOW-seq整合细菌生长状态谱与空间转录组学，通过荧光染料标记和FACS分选关联空间位置与转录活性。Stereo-seq V2利用随机引物捕获福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的总RNA，同时捕获宿主和微生物RNA，适用于研究宿主-微生物相互作用。但标准空间转录组学工作流因原核转录本缺乏poly(A)尾导致细菌RNA回收率低，通过原位多腺苷酸化酶促增强方法可实现100倍改善。测序基础空间技术的分辨率受阵列点大小和平均扩散距离共同限制，微生物细胞微小且内部拥挤，目标分子侧向扩散可能导致单细菌分辨率难以实现。
5.3 空间应用与生物学洞察
5.3.1 群落结构分析
SEER-FISH分析拟南芥根相关微生物群，揭示Acidovorax sp.和Agrobacterium sp.为优势类群，表现出非随机交叉关联和接触频率。HiPR-FISH显示抗生素处理破坏细菌属间空间关联，如Oscillibacter和Veillonella的空间关系。
5.3.2 生态位关系发现
SAMPL-seq分析人类肠道微生物群，发现B. vulgatus/dorei与Akkermansia rectalis之间的跨门共关联，以及R. bicirculans/champanellensis与某些Lachnospiraceae成员之间的反关联，反映了竞争和生态位分化。
5.3.3 宿主相关空间微生物图谱
Bacterial-MERFISH分析小鼠结肠显示Bacteroides thetaiotaomicron优先定位于黏液层附近，表达黏液代谢基因。Stereo-seq V2在结核分枝杆菌(Mtb)感染小鼠模型中同时捕获宿主和病原体RNA，在人类肺结核组织样本中揭示B细胞受体(BCR)克隆的空间分布和突变特征，鉴定出跨患者共享的Mtb特异性BCR克隆。
5.3.4 生物膜代谢空间组织
Par-seqFISH分析铜绿假单胞菌生物膜，早期(10h)高表达适应和防御相关基因(mexB)，晚期(35h)表现出时间进化。RAINBOW-seq鉴定出生物膜内三种空间相互作用模式：跨区域营养转移、跨区域信号反馈、局部营养循环。
6. 讨论
微生物单细胞分析的核心障碍包括“尺寸屏障”（亚微米级细胞超出检测极限）、低模板量依赖信号放大引入偏差、参考数据库和引物/探针主要基于已知可培养微生物导致未培养类群（“暗物质”）不可见。这些实验约束导致数据质量面临共同问题：污染、低文库复杂度、信号模糊。现有工具多针对真核系统设计，缺乏微生物专用质量控制框架。从单物种到复杂微生物群落的过渡增加了分类和功能解释的复杂性，需开发跨物种功能比较策略。计算分析成为日益突出的瓶颈，包括数据稀疏性、零膨胀、缺乏完整参考基因组、标准化流程稀缺。技术整合和跨模态分析面临挑战，需开发能同时适应真核和原核细胞的空间分析框架。未来方向包括开发微生物原生分析框架、应用深度学习进行跨模态整合和“暗物质”功能预测，以及适应微生物群落研究的新兴技术如膨胀显微镜结合原位测序、纳米孔直接RNA测序、单分子蛋白水平检测。
7. 结论
微生物单细胞和空间组学通过将分辨率从群体平均转向单个细胞，改变了微生物群落研究。这些技术表明表型异质性、空间组织和菌株水平多样性是微生物生命的基本特征。方法学进展涵盖从FACS和微流控细胞分离到组合条形码和靶向探针策略，再到成像和测序基础空间图谱。scDNA-seq实现了物种水平基因组重建和新未培养菌株发现，空间方法揭示了微生物群落的非随机组织。当前主要瓶颈是技术和计算层面的，克服这些挑战将推动临床诊断、抗生素耐药性监测和生物技术发现。最深刻的进展可能来自单细胞分辨率与空间背景的整合。
