叶酸预防神经管缺陷需要ALDH1L1产生的视黄酸

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Folic acid prevention of neural tube defects requires retinoic acid produced by ALDH1L1

　　

妊娠期补充叶酸（FA）是预防神经管缺陷的常用治疗方法，但其预防神经管缺陷（NTDs）的机制仍不清楚。FA还可预防其他发育畸形，包括胎儿酒精综合征模型中的酒精诱导畸形。研究人员证明，FA通过代谢连接视黄酸（RA）信号发挥作用。利用FA可挽救的pax3敲低爪蟾（Xenopus）模型，研究人员发现，RA或其前体同样能挽救这些缺陷。类似地，在先前已被证明可由视黄素类挽救的模型中，FA也能挽救酒精诱导的NTDs。研究人员鉴定出FA代谢酶——甲酰四氢叶酸脱氢酶（ALDH1L1，FTHFD），由aldh1l1基因编码，是该挽救过程的关键。机制上，FA上调aldh1l1表达，从而增加RA生物合成。使用CRISPR/Cas9敲低ALDH1L1活性会消除FA的保护效应。为支持这些观察，研究人员证明，人ALDH1L1酶可将视黄醛（retinaldehyde）转化为RA，且其过表达在提供视黄醛时可恢复aldh1l1敲低胚胎的神经管闭合。在细胞水平，RA信号减少导致神经板前体细胞过度增殖和神经管病理性扩张。ALDH1L1使FA能够恢复正常的神经板增殖，从而预防NTDs。这些发现将ALDH1L1确立为FA（维生素B9）与RA信号之间意想不到的酶促连接，揭示了FA补充如何保障神经发育，并提示了改进NTD预防策略的机会。

**研究背景与问题**
神经管缺陷（NTDs）是中枢神经系统（CNS）发育异常，全球每10,000名新生儿中约19例发生。尽管叶酸（FA，维生素B9）补充在全球范围内成功降低了NTD发病率，但其确切机制、最佳剂量及部分病例失败的原因仍存在争议。FA也预防其他发育畸形，如胎儿酒精综合征（FAS）中的酒精诱导畸形，而降低视黄酸（RA）水平会导致类似FAS的畸形。此前研究已知，乙醇（EtOH）代谢产物乙醛与视黄醛（RAL）竞争胚胎视黄醛脱氢酶2（RALDH2，ALDH1A2）活性，减少RA合成，导致畸形。FA可挽救这些缺陷，但分子机制未知。本研究旨在阐明FA如何通过代谢连接与RA信号协同预防NTDs，为优化预防策略提供依据。该论文发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

**主要技术方法**
研究人员利用爪蟾（Xenopus laevis）胚胎建立两种NTD诱导模型：pax3基因CRISPR/Cas9敲除（CRISPant）和RA合成抑制剂（DEAB或EtOH）处理。通过CRISPR/Cas9技术靶向aldh1l1基因，结合人ALDH1L1 mRNA过表达和视黄醛（RAL）补充进行功能验证。采用qPCR分析基因表达，全胚胎原位杂交（WISH）观察神经管形态，免疫荧光染色检测磷酸化组蛋白H3（pHH3）评估细胞增殖。体外酶动力学分析人ALDH1L1蛋白氧化视黄醛生成RA的活性，并利用小鼠F9畸胎瘤细胞RA报告细胞系验证FA对RA信号的上调作用。样本来源：爪蟾胚胎购自Xenopus 1或Nasco，小鼠细胞系为标准商业来源。

**研究结果**
**FA Rescues NTC Defects in Reduced RA and pax3 Knockdown Models.**
通过pax3 CRISPant（Xsplotch模型）和RA合成抑制（DEAB或EtOH处理）两种模型，研究人员发现FA（200 nM）均能显著降低神经管闭合（NTC）缺陷发生率。RA前体（视黄醇ROL或视黄醛RAL）同样有效，且FA与RA前体的挽救时间窗口一致（中囊胚过渡期NF8.5最有效，晚囊胚期NF10.25后减弱），表明FA通过促进RA合成发挥作用。

**Rescue of NTC Defects by Folic Acid Involves RA Biosynthesis.**
FA处理显著上调RA靶基因（hoxa1、hoxb1、hoxd1、hoxb4、cyp26a1、dhrs3）的表达，且过表达RA羟化酶Cyp26a1能完全消除FA的挽救效应，证明FA的挽救依赖于RA的产生。此外，FA必须被二氢叶酸还原酶（DHFR）还原为四氢叶酸（THF）才能发挥作用，因甲氨蝶呤（MTX）抑制DHFR后阻断FA挽救。

**ALDH1L1 Is Essential for the Rescue of NTC Defects by Folic Acid.**
FA处理上调一碳代谢基因aldh1l1（编码甲酰四氢叶酸脱氢酶ALDH1L1），该酶与视黄醛脱氢酶同源。在pax3和aldh1l1双CRISPant胚胎中，FA无法挽救NTC缺陷；而人ALDH1L1过表达配合RAL补充可恢复挽救。在DEAB或EtOH处理的aldh1l1 CRISPant中，FA同样失效。补充RA、ROL或RAL可挽救aldh1l1 CRISPant的缺陷，但FA不能，证实ALDH1L1是FA介导RA合成的关键酶。

**Conservation of the FA–ALDH1L1–RA Pathway in Mammals.**
体外酶动力学显示，人ALDH1L1以NADP⁺为辅因子氧化全反式视黄醛（atRAL），Km为4.1±0.47 μM，Vmax为2.94±0.07 μmol/min/mg酶。小鼠F9 RA报告细胞中，FA处理（50-100 nM）剂量依赖性地增加RA报告活性，上调RA响应基因（Hoxb1、Hoxb3、Hoxb5）和Aldh1l1表达，证明该通路在哺乳动物中保守。

**Folic Acid Alters the Spatial Expression of ALDH1L1 during Gastrulation.**
aldh1l1转录本在原肠胚早期（NF10.5）开始积累，主要定位于侧部边缘区（LMZ）。FA处理使aldh1l1表达量增加约1.5倍，并改变其空间分布：背部边缘区（DMZ）相对表达量从23.38%升至45.87%，而LMZ从55.56%降至26.61%，使ALDH1L1活性更接近形成中的神经板。

**ALDH1L1 Activity Restricts Neural Plate Expansion during FA Rescue.**
单侧aldh1l1 CRISPant胚胎中，CRISPant侧神经板增殖细胞（pHH3阳性）显著多于对照侧（平均59.5 vs 51.8）。DEAB处理进一步增加增殖，FA仅能恢复对照侧的正常增殖水平，而CRISPant侧仍维持高增殖（Δ=28.9），证明ALDH1L1是FA抑制神经板过度增殖所必需的。

**Optimizing Folic Acid and Retinoid Supplementation for NTD Prevention.**
低浓度FA（25 nM）单独处理对DEAB诱导的NTD挽救效果弱，联合低浓度RA（5-20 nM）或低浓度ROL（1-5 μM）后显著提高挽救效率。低ROL（5 μM）与低FA（50 nM）联合处理效果优于单独FA，提示维生素A可增强FA的预防效果。

**讨论与结论**
研究揭示FA通过上调ALDH1L1促进RA生物合成，从而预防NTDs。这一机制解释了FA与RA信号之间意外的代谢连接，并表明FA的挽救需要ALDH1L1活性。此外，维生素A（ROL）在生理范围内可增强FA的挽救效率，提示优化FA与维生素A水平可能改善当前预防策略。研究结论：这些发现将ALDH1L1确立为FA（维生素B9）与RA信号之间意想不到的酶促连接，揭示了FA补充如何保障神经发育，并提示了改进NTD预防策略的机会。