《International Journal of Biological Macromolecules》：Fluorescence imaging-based investigation of tau-mediated promotion of U1 small nuclear ribonucleoprotein 70?kDa co-phase separation
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摘要由Tau蛋白形成的神经纤维缠结是阿尔茨海默病的重要病理特征。虽然人们认为Tau蛋白的液-液相分离会引发其聚集，而且含有碱性-酸性二肽结构域的U1小核核糖核蛋白70 kDa（U1-70K）会在阿尔茨海默病患者的大脑中与Tau缠结异常共定位，但二者共同聚集的分子机制仍不清楚。在本
摘要
由Tau蛋白形成的神经纤维缠结是阿尔茨海默病的重要病理特征。虽然人们认为Tau蛋白的液-液相分离会引发其聚集，而且含有碱性-酸性二肽结构域的U1小核核糖核蛋白70 kDa（U1-70K）会在阿尔茨海默病患者的大脑中与Tau缠结异常共定位，但二者共同聚集的分子机制仍不清楚。在本研究中，我们发现Tau蛋白会与两个低复杂度结构域（LC1/LC2）发生共相分离。在实验条件下，LC1和LC2都会促进Tau滴液的凝胶化以及病理性Tau聚集体的形成。此外，在细胞受到应激时，Tau蛋白和U1-70K会在细胞质中异常共定位，这表明在病理状态下二者之间存在功能关联，也为理解阿尔茨海默病中Tau蛋白病理变化的分子机制提供了新思路。
引言
液-液相分离为理解Tau蛋白的病理性聚集机制提供了新的研究视角。作为一种由浓度驱动的物理化学过程，液-液相分离能使蛋白质形成无膜结构的液体凝聚物。越来越多的研究表明，Tau蛋白以及各种神经退行性疾病相关标志蛋白的液-液相分离状态很可能是它们转化为固体纤维沉积物之前的早期阶段[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。Tau蛋白由MAPT基因编码，通过可变剪接生成六种亚型，这些亚型在N端插入片段的数量（0N、1N、2N）以及微管结合重复序列的数量（3R、4R）上存在差异。先前的研究指出，不同亚型可能具有不同的液-液相分离和聚集特性[6]。基于此，本研究选择了在成人脑组织中较为丰富的2N4R亚型作为研究对象。
最近的研究发现，U1小核核糖核蛋白70 kDa（U1-70K），作为U1 snRNP复合物的组成部分，会因异常聚集并与Tau缠结共定位而参与阿尔茨海默病的病理过程[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。U1-70K由437个氨基酸组成，分子量约为52 kDa，其结构包括N端区域、RNA识别基序以及两个C端的低复杂度结构域。作为U1 snRNP复合物的核心组分，U1-70K负责识别剪接位点，在早期剪接体组装过程中起着关键的调控作用[12]、[13]。值得注意的是，在家族性及散发性阿尔茨海默病患者的脑组织中，U1-70K会形成高度不溶的聚集体，这些聚集体会异常积累在神经元细胞质中，形成类似缠结的结构[14]。与Tau蛋白不同，U1-70K的异常定位和聚集仅出现在阿尔茨海默病患者身上，其他类型的痴呆症或神经退行性疾病中并未观察到这种现象[7]。此外，阿尔茨海默病患者的脑组织匀浆能够诱导可溶性U1-70K聚集，而皮质基底节变性患者的脑组织匀浆则不具备这种能力[8]。在表达N40K（U1-70K的1–300号氨基酸序列）的细胞模型和小鼠模型中，N40K会与内源性的U1-70K竞争结合到U1 snRNP复合物上，从而导致剪接体异常组装以及整体剪接缺陷，进而引发神经元退化并导致严重的记忆障碍[15]、[16]。这些发现支持了阿尔茨海默病中存在独特的U1 snRNP相关病理变化，并表明剪接体功能障碍与神经退行性变之间存在密切关联。
U1-70K的聚集倾向主要归因于其内在无序区域，该区域包含两个低复杂度结构域：LC1（231–308号氨基酸序列）和LC2（317–407号氨基酸序列）。这两个结构域都具有内在的聚集倾向；例如，仅包含LC1的N40K片段就足以在原代海马神经元中引发神经退化[15]、[16]。从结构上看，LC1和LC2富含高度重复的碱性（精氨酸/赖氨酸）和酸性（天冬氨酸/谷氨酸）氨基酸残基，因此被归类为碱性-酸性二肽结构域。值得注意的是，含有碱性-酸性二肽结构域的RNA结合蛋白在阿尔茨海默病患者的脑蛋白组中含量较高，而且U1-70K的这一结构域已被证实能与阿尔茨海默病患者脑组织匀浆中的病理性Tau亚型发生相互作用[6]。然而，LC1和LC2介导这种相互作用的分子机制，以及它们对Tau蛋白聚集的作用是否存在差异，目前尚不清楚。
由于液-液相分离是形成无膜细胞器的关键机制，而且已被证实与多种神经退行性疾病相关蛋白的聚集有关，包括Tau蛋白[2]、[17]，因此我们推测U1-70K的LC1和LC2结构域可能会促使Tau蛋白与其发生共相分离，进而形成混合凝聚物，而这可能代表了二者病理性共同沉积的早期阶段。全长U1-70K蛋白结构复杂，难以纯化，而将其分离出的LC1和LC2结构域则可作为易于操作的体外模型，用于研究碱性-酸性二肽结构域介导的相分离现象以及Tau蛋白之间的相互作用[17]、[18]。不过，LC1和LC2各自的液-液相分离特性及其驱动因素，以及它们对Tau蛋白相分离和聚集的具体影响，目前仍缺乏深入了解。尤其需要明确的是，LC1和LC2在促进Tau蛋白凝聚方面是否采用相似的机制，还是通过不同的分子作用力产生不同的效应。
在本研究中，我们重点关注U1-70K的碱性-酸性二肽结构域（LC1/LC2），并从液-液相分离的角度探讨它们如何调节Tau蛋白的相分离和聚集过程。我们的目标是明确Tau蛋白与LC1、LC2之间的共相分离现象，解析驱动这些相互作用的分子机制，并比较LC1和LC2在促进Tau蛋白聚集过程中的不同作用。研究发现，在共相分离系统中，Tau蛋白会与LC1/LC2片段发生共相分离，进而增强这些片段的相分离倾向。鉴于U1-70K和Tau蛋白都是与阿尔茨海默病密切相关的关键病理蛋白，阐明二者共相分离与病理性共同聚集之间的内在联系，将为理解阿尔茨海默病患者大脑中U1-70K和Tau蛋白的共同沉积提供重要的机制依据，同时也有助于为针对这种病理相互作用的未来治疗策略提供参考。
章节要点
试剂与材料
原核表达载体pET-28a-mCherry和pET-28a-EGFP，以及大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）菌株，均购自中国武汉的妙灵生物技术公司。真核表达质粒pCDNA3.1-mCherry-Tau和pCDNA3.1-EGFP-U1-70K则来自中国湖南的丰汇生物技术公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自英国巴斯廷斯的Oxoid公司。异丙基β-D-1-硫半乳糖吡喃苷和核糖核酸酶A则由Solarbio公司提供。
不同作用力下Tau、LC1和LC2的液-液相分离现象
为了预测Tau蛋白和U1-70K的相分离行为，我们分析了它们的内在无序性、电荷分布以及疏水性。研究结果表明，Tau蛋白以及U1-70K的LC1/LC2区域都具有高度的无序性，且含有大量带正电的碱性氨基酸残基和带负电的酸性氨基酸残基（见图S1和S2），这说明这两种蛋白都极易发生液-液相分离。我们使用PEG-10000作为惰性分子填充剂，通过排除体积效应来促进液-液相分离的发生[19]。为了可视化这一过程
结论
总之，本研究表明Tau蛋白可作为支架蛋白，与U1-70K的碱性-酸性二肽结构域（LC1/LC2）发生共相分离，进而促进滴液成熟以及病理性Tau蛋白聚集体的形成。在生理条件下，Tau蛋白以可溶的单体形式存在。而在存在LC结构域的情况下，Tau蛋白的微管结合重复序列所具有的静电吸引力，以及其内在无序区域所具有的疏水相互作用都会得到增强，从而使Tau蛋白能够与这些结构域发生相互作用。
CRediT作者贡献说明
彭博宇：论文撰写——初稿撰写、方法学研究、实验分析。邹帅：方法学研究、实验分析、数据整理。史永岩：方法学研究、实验分析。朱晓华：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资金申请、研究构思。刘美玲：方法学研究。李海涛：研究指导、资金申请。张有玉：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资金申请、研究构思。
利益冲突声明
作者们确认，支撑本研究结果的所有数据均保存在论文正文及其补充材料中。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（项目编号为22274045和22274048）。
Boru Peng|Shuai Zou|Yongyan Shi|Xiaohua Zhu|Meiling Liu|Haitao Li|Youyu Zhang
