突破定性瓶颈：植物体内定量分裂荧光素酶互补技术（SplitLUC）干货指南

两个蛋白真正“握手”的瞬间，如何被科学家看到？

生命活动的本质，是大量蛋白质之间精准、有序的相互作用。植物感知外界环境变化，需要受体蛋白识别信号分子；植物抵御病原侵染，需要免疫蛋白形成复合物；植物响应激素刺激，需要转录因子与调控蛋白动态结合。因此，蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）研究一直是植物分子生物学的重要方向。

分裂荧光素酶互补技术（Split Firefly Luciferase Complementation Assay, 简称 SplitLUC）因其高灵敏度和极低背景噪声，已成为植物研究领域的“明星”技术之一 。

然而，传统的 SplitLUC 在实际应用中常常演变成一种“只能看有无，无法定强弱”的粗放型定性实验。如何消除固有的叶片差异、表达不均等技术偏倚，实现高精度的定量化分析？

最新发表在Protoplasma上的一项由德国卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）团队带来的研究，为我们提供了一套完美的解决方案：通过将基于高性能冷CCD的成像系统与内参荧光标定相结合，建立了高度精准的植物体内定量 SplitLUC 技术体系。本文将立足于这一前沿方法学，为您奉上一份沉甸甸的SplitLUC定量实验“纯干货”指南。

一、主流植物原位 PPI 技术横评

• 酵母双杂交(Y2H)：适合高通量筛选，操作成熟；但属于异源系统，缺乏植物特异性修饰与细胞器环境。

• 共免疫共沉淀 (Co-IP)：反映真实的体内多蛋白复合物；但难以区分为“直接物理结合”还是“处于同一复合物中”。

• 双分子荧光互补 (BiFC)：可进行精细的细胞内定位观察；但荧光基团重构不可逆，易产生假阳性，对照极其严苛。

• 定量SplitLUC：灵敏度极高，假阳性低；引入内参消除叶片误差；但是需多功能酶标仪与高灵敏度活体成像系统配合。

传统SplitLUC痛点：不同叶片或同一叶片不同区域的转入效率、表达丰度差异极大。若直接用绝对发光值（cps）评估相互作用强弱，易得出错误结论。

图1. 利用 NightSHADE 系统对本氏烟草 (Nicotiana benthamiana, Nb) 中的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 进行 SplitLUC 检测

二、定量的核心改良：双读数与归一化

为了彻底消除“叶片间差异（leaf-to-leaf variation）”，KIT 研究团队引入了双读数（Dual-readout）归一化策略：

1. 目标交互信号：靶蛋白 A 和 B 分别融合萤火虫荧光素酶的 N 端（nLUC）和 C 端（cLUC）。两蛋白结合促使荧光素酶恢复活性，在底物 D-luciferin、ATP 和 O2存在下产生生物发光。

2. 内部表达量监控：混样侵染时，同步混入表达 TagRFP（红色荧光蛋白） 的农杆菌。TagRFP 的荧光强度直接反映了该区域的转殖效率与整体翻译水平。

三、标准化定量实验步骤（以 DDA1 与 PYL8 为例）

以下流程以拟南芥 CUL4-E3 泛素连接酶复合体组分 DDA1 与脱落酸受体 PYL8 的相互作用验证为例。

1. 质粒构建与农杆菌转化

• 载体构建：采用 CaMV 35S 启动子的二元表达载体 pCAMBIA1300-nLUC 和 pCAMBIA1300-cLUC。

• 转化：转化至农杆菌菌株 GV3101 (pMP90) 中。同时准备携带 35S::TagRFP 的农杆菌作为内参菌。

2. 菌液配制并混样

3. 本氏烟草注射与培养

1. 选择生长健壮的 4 周龄本氏烟草，优选顶部向下第 3-4 片完全展开的叶片。

2. 使用 1 ml 一次性针头注射器，从叶片背面（下表皮）缓缓注入菌液。单片叶片可划分 4 个象限，分别注射实验组与对照组。

3. 注射后先置于黑暗、高湿环境培养 24h，随后转至标准长光照环境（16h 光照/8h 黑暗）继续培养 48h。

4. 活体发光成像（生物发光检测）。为捕捉高保真的弱光子信号，实验采用德国Berthold Technologies公司的NightSHADE evo植物活体成像系统：

1. 底物喷洒：采摘叶片，背面朝上置于 MS 琼脂平板上。用微型喷雾瓶将 5 mM D-luciferin 钾盐工作液（含 0.025% Triton X-100）均匀喷洒于叶面。

2. 暗适应（核心细节）：喷洒后必须在绝对黑暗中静置孵育 15 min。此举能淬灭叶绿素产生的自发荧光，消除背景噪声。

3. 信号采集：将平板放入 NightSHADE 密闭暗箱中，设置：曝光时间20s、低增益、慢速读出、8*8像素合并。

4. 图像处理：利用其内置的 IndiGO™ 软件进行背景校正和宇宙射线抑制。软件自动将绝对发光强度（cps）转化为伪彩色热图，并与白光背景图无缝叠加，精准锁出发光区域（ROI）。

5. 叶片打孔与内参荧光测定

1. 根据 IndiGO™ 软件标记的 ROI 位置，使用直径 8 mm 的叶片打孔器（leaf punch）切取对应的叶圆片。

2. 将叶圆片背面朝上，置于 96 孔半面积黑色微孔板中，每孔加入 200 µl 蒸馏水。

3. 使用多功能酶标仪读取 TagRFP 红色荧光：激发波长 543 nm，发射波长 589 nm。

四、数据处理与统计

1. 计算 RLU：将各 ROI 的生物发光值（cps）除以对应叶圆片的 TagRFP 荧光强度（cps）。

2. 生物学重复：为确保统计学稳健性，每种组合必须采集来自 6 株不同植株的独立叶片样本，且每个侵染点推荐切取 6-7 个叶圆片取均值。

3. 结果分析：经 TagRFP 归一化后，DDA1-nLUC + cLUC-PYL8 组合的相对发光值显著高出对照组 3 倍以上。这无可辩驳地证明了 DDA1 与 PYL8 在植物体内的特异性物理结合。

图2. DDA1 与 PYL8 存在物理相互作用，如 SplitLUC 检测所示

五、硬件优选：为什么Berthold NightSHADE evo是定量级标配？

迈向“精准定量”时，简易的发光暗箱常因噪声高、信号溢出或边缘衰减影响结果。Berthold NightSHADE evo 系统则是定量级植物原位实验的利器：

• 深冷CCD相机：具备极低的暗电流噪声，即使面对微弱或瞬时的相互作用（如激酶与底物结合、低丰度转录因子复合物），也能通过长积分稳定捕获弱光子。

• 高精度空间分辨：农杆菌浸润区边缘与中心的表达往往不均。NightSHADE 配合 IndiGO™ 软件，能将高分辨率发光信号与白光图无缝叠加。研究者可直接在软件中勾勒不规则的真实 ROI 并导出积分均值，免去了手动分割图片的几何误差与主观偏见。

• 植物生理环境模拟：暗箱内部可配置温控、湿度调节及生长级 LED 光源，支持不脱离活体生长状态的长时间动态监测（如观测植物在遭受盐害、干旱或激素处理后，蛋白解离的动态曲线）。

更多信息请点击：顶级植物实验室都在使用的设备：NightSHADE 到底厉害在哪里？

实用避坑指南

1. 控水与植株状态： 注射前一天切忌过度浇水。若叶肉细胞过度饱和，注射时极易出现组织撕裂或大面积水渍坏死。

2. 严格控制 Triton X-100 浓度： 0.025% 的表面活性剂是为了打破表皮蜡质层。切勿盲目加大浓度，否则高浓度去污剂会破坏细胞膜完整性，导致植物细胞提前发生过敏性坏死。

3. 保证 15 min 暗孵育： 植物叶绿体的延迟发光和自发荧光非常顽固，暗适应时间不足会引入大量环境背景假信号，干扰归一化结果。

4. 如果遇到极弱相互作用怎么办：如果您的靶蛋白属于弱相互作用，在 NightSHADE 软件中调高Binning（如设为 16*16）可以牺牲空间分辨率来换取光子敏感度的成倍提升，同时适当延长曝光至 60 秒 。配合 TagRFP 归一化，弱信号依然能被精准定量出来。

从“定性观察”跨越到“精准定量”，是植物分子生物学迈向精细化的必然趋势。通过引入TagRFP内参归一化体系，并借助Berthold NightSHADE evo 植物活体成像系统的尖端冷CCD光学检测能力 ，曾经令科研人员头疼的植物叶片表达异质性已被成功降服。掌握这套标准化干货流程，您的植物 PPI 研究必将在定量的加持下更具说服力！

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