转染效率飙升，我只做对了一件事

超螺旋不足带来的实际问题

1. 相同质粒用量下荧光 / WB 信号弱，表达量低；

2. 转染重复性差，孔间表达差异大；

3. 高剂量质粒也无法提升表达，只会增加细胞毒性；

4. 慢病毒 / 腺病毒包装时，包装滴度大幅下降（病毒包装极度依赖高超螺旋质粒）。

超螺旋质粒占比越高，转染效率越高、表达量越高。质粒超螺旋≥90%最优，低于70%转染会明显变差。

为什么超螺旋高更利于转染？

1. 分子紧凑、体积小

超螺旋质粒紧密缠绕，流体力学半径远小于松弛开环质粒；更容易被脂质体 / PEI 等转染试剂包裹形成稳定复合物，更容易穿过细胞膜内吞进入细胞。

2. 抵抗核酸酶降解

超螺旋紧密折叠，DNA 骨架被保护，胞外、胞质内 DNase 不易切割；开环单链缺口极易被降解，大量质粒在到达细胞核前断裂失效。

如何提高质粒超螺旋比

核心原理：减少 DNA 单链缺口、养好菌，选择正确的纯化方式、避免剪切和过度裂解、温和提取操作、规范储存，缺口越少，开环越少，超螺旋占比越高。

一、细菌培养阶段（源头减少开环产生）

1. 菌体不要过度生长 

37℃、220 rpm 温和摇菌，避免剧烈震荡，建议持续12至16小时。

富营养培养基，如2x YT（酵母/胰蛋白胨）、TB（优质培养基）或CircleGrow，细菌生长速度更快，进入静止期的时间比LB培养基更早（≤12小时）

培养液体积是培养瓶的1/3，以提供富含氧气的生长环境。

过度培养可能导致死细胞或饥饿细胞比例升高，从而导致质粒DNA部分降解或被染色体DNA污染

2. 抗性筛选充足，避免杂菌 / 缺质粒菌体

抗生素浓度足量，防止质粒丢失，杂菌代谢物会释放 DNase 降解质粒。

3. 低温收菌

离心 4℃收集菌体，室温放置过久菌体自溶，内源 DNase 释放破坏超螺旋。

二、碱裂解提取（最容易产生开环，重中之重）

1. 裂解时间

室温裂解时间严格控制： 

加裂解液后轻柔颠倒 5~6 次，静置≤3 min，严禁长时间放置；强碱会破坏 DNA 磷酸二酯键，产生大量缺口。

2. 全程轻柔操作，杜绝剧烈吹打、涡旋

超螺旋 DNA 长链极易被剪切： 

混匀只用颠倒离心管，禁止涡旋；

转移液体用宽口枪头，不用细尖枪快速吹打；

核酸沉淀室温平衡溶解，杜绝吸头吹打。

三、纯化方式选择（关键性作用）

1. 普通硅胶膜

≥8000g 反复离心，离心拉扯力会不同程度的破坏质粒的超螺旋结构

2.阴离子交换柱

裂解液，清洗液和洗脱液重力过柱，拉扯力非常的小。

能把超螺旋比例提高到 90% 以上，同时去除内毒素。

3.氯化铯 CsCl 密度梯度离心（金标准）

根据浮力密度差异彻底分离超螺旋（密度更高）与开环，超螺旋纯度可达 95%+；缺点操作繁琐、有 EB 毒性，多用于高标准病毒包装。四、除内毒素辅助保护超螺旋

国内客户测试结果：

相同的菌液，分别采用普通硅胶膜离心和阴离子交换树脂重力柱两种提取方式。提取后的质粒进行凝胶电泳检测和质粒转染D1后荧光成像。

不同原理提取出来的质粒进行凝胶电泳检测：

质粒转染D1后荧光成像

四、质粒储存条件（防止后期降解产生开环）

1. 分装冻存，杜绝反复冻融

反复冻融产生冰晶切割 DNA，形成大量缺口开环；分装成 20~50 μL 小份，-20℃或 - 80℃保存。

2. 储存缓冲液优选 pH8.0 TE

Tris-EDTA 缓冲液螯合金属离子（Mg²⁺是 DNase 辅因子），抑制核酸酶活性；

不建议长期纯水储存，纯水无缓冲能力，pH 波动易损伤 DNA。

3. 避免室温长期放置

稀释后的工作液现用现配，室温放置超过 4 h 超螺旋明显下降。

4. 避光保存

紫外、强光会造成 DNA 单链断裂。

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