电针改善慢性睡眠剥夺诱导的神经认知损伤：一项基于海马神经发生和突触可塑性的实验研究

《Frontiers in Human Neuroscience》：Electroacupuncture improves neurocognitive impairment induced by chronic sleep deprivation: an experimental study based on hippocampal neurogenesis and synaptic plasticity

　　

目的：正常睡眠节律对于海马依赖的高级认知功能至关重要。慢性睡眠剥夺（CSD）会损害海马神经发生和结构，导致神经认知缺陷。电针颈针（ENA）在双侧风池（GB20）和供血（Extra）是一种专门治疗失眠、健忘及其他脑源性疾病的针灸技术。本研究旨在探讨ENA是否通过调节海马神经发生和突触可塑性改善CSD诱导的认知损伤。方法：采用改良多平台水环境法建立CSD模型。使用电针或假电针治疗双侧颈部穴位（风池和供血），每次20分钟，每天1次，连续14天。Morris水迷宫实验评估大鼠的空间学习和记忆能力，新物体识别实验评估识别记忆。采用免疫荧光（IF）染色和免疫印迹（Western Blot, WB）检测海马神经发生标记物双皮质素（DCX）和Ki-67的表达水平。使用Golgi-Cox染色和透射电镜观察海马齿状回（DG）神经元和突触可塑性的变化。结果：CSD诱导的神经认知损伤与海马神经发生和突触可塑性的异常变化相关。IF和WB结果显示，CSD大鼠海马中DCX和Ki-67的蛋白表达显著降低。透射电镜显示，在CSD大鼠海马DG区，突触密度和突触后致密膜厚度降低，而突触间隙宽度增加。Golgi染色显示，CSD大鼠海马DG区树突棘密度显著降低，尤其是蘑菇状树突棘。ENA能够增强CSD诱导的空间学习和记忆以及识别记忆，并有效逆转海马DG区神经发生和突触可塑性的异常变化。结论：在雄性Wistar大鼠中，ENA通过促进海马齿状回神经发生和恢复突触可塑性，从而重建神经记忆回路，改善神经认知功能。ENA疗法为治疗与男性慢性睡眠剥夺相关的认知损伤提供了新策略，并对认知损伤疾病的临床管理具有潜在意义。

睡眠不足已成为全球性公共卫生问题，社会压力、环境污染和慢性疾病等因素导致其普遍存在。慢性睡眠剥夺（chronic sleep deprivation, CSD）扰乱自然昼夜节律，减少总睡眠时间，损害认知功能，并加剧焦虑和抑郁症状，尤其在轮班工作者中更为常见。约20%的成年人患有失眠，5年内持续率高达40%。睡眠剥夺损害注意力、决策和记忆等多种认知域，长期睡眠不足还可能阻碍β-淀粉样蛋白清除，加速阿尔茨海默病病理进程。常规药物治疗认知损伤效果有限，常仅提供症状缓解并伴有副作用，因此非药物干预如针灸日益受到关注。研究表明，穴位刺激对认知功能有显著影响，电针颈针（electro-nape-acupuncture, ENA）在双侧风池（GB20）和供血（Extra）治疗是一种专门针对脑源性疾病的针灸技术，由高维滨教授研发，临床已显示对失眠及伴随的焦虑、抑郁和记忆下降有改善作用。然而，ENA对海马神经元神经保护作用的机制尚不明确。海马在记忆编码和存储中至关重要，海马神经发生受损是认知障碍的公认致病机制。CSD通过诱导氧化应激、神经炎症和蛋白聚集破坏海马微环境，抑制神经发生。本研究假设ENA通过增强海马神经发生和突触可塑性减轻认知功能障碍，并采用改良多平台水环境法建立CSD模型，观察齿状回（dentate gyrus, DG）神经元和突触可塑性变化，检测神经发生相关分子双皮质素（doublecortin, DCX）和Ki-67的表达，以阐明ENA改善CSD相关认知损伤的机制。该研究发表在《Frontiers in Human Neuroscience》。

研究人员采用的关键技术方法包括：使用改良多平台水环境法（modified multi-platform method, MMPM）建立CSD模型，共21天，每天剥夺睡眠18小时，恢复6小时；使用Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）和新物体识别（novel object recognition, NOR）实验评估空间学习和记忆及非空间识别记忆；通过免疫荧光（immunofluorescence, IF）和免疫印迹（Western blot, WB）检测海马DG区神经发生标记物DCX和Ki-67的定位和定量表达；利用透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）观察神经元超微结构和突触形态；采用Golgi-Cox染色评估树突棘密度和形态。样本来源：60只雄性无特定病原体Wistar大鼠，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

研究结果分为以下部分：

**ENA改善CSD大鼠的空间学习和记忆能力**：通过Morris水迷宫实验，与水箱对照组（TC组）相比，模型组（Mod组）和假ENA组逃避潜伏期显著延长（F=29.54, p<0.001），目标象限停留时间减少（F=30.70, p<0.001），平台穿越次数减少（F=12.80, p<0.001）。ENA组与Mod组相比，逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间增加，平台穿越次数增多，表明ENA增强了CSD大鼠的空间学习和记忆。

**ENA改善CSD大鼠的非空间识别记忆**：在新物体识别实验中，与TC组相比，Mod组和假ENA组总探索时间（F=41.14, p<0.001）、新物体探索时间（F=83.26, p<0.001）和识别指数（F=11.87, p<0.001）均显著降低。ENA组与Mod组相比，这些指标均显著增加，表明ENA改善了CSD大鼠的非空间识别记忆。

**ENA增加CSD大鼠海马DG区Ki-67和DCX的定位表达**：免疫荧光分析显示，Mod组和假ENA组Ki-67⁺和DCX⁺的平均荧光强度较TC组显著降低（Ki-67: F=49.00, p<0.001; DCX: F=67.21, p<0.001），表明CSD后DG区神经元增殖和分化功能抑制。ENA组较Mod组平均荧光强度升高，说明ENA促进海马DG区神经发生过程。

**ENA增加CSD大鼠海马Ki-67和DCX的定量表达**：Western blot分析结果与IF一致，Mod组Ki-67和DCX相对蛋白表达较TC组显著降低（Ki-67: F=5.927, p=0.005; DCX: F=10.319, p<0.001），ENA组较Mod组显著升高，表明ENA干预可上调神经发生标记物表达，促进海马神经发生。

**ENA促进CSD大鼠海马DG区神经元的修复**：透射电镜观察超微结构，TC组神经元形态正常，核膜完整，染色质均匀，细胞器丰富。Mod组和假ENA组神经元出现细胞收缩、核膜凹陷、染色质聚集、线粒体肿胀空泡化、嵴断裂、内质网扩张和溶酶体增多。ENA组神经元核结构更完整，染色质呈颗粒状，线粒体仅轻度肿胀，嵴保存较好，表明ENA治疗可减轻DG区神经元损伤。

**ENA恢复CSD大鼠海马DG区突触形态结构并增加突触数量**：透射电镜分析DG区突触，Mod组和假ENA组突触结构模糊，突触小泡减少，突触数量显著减少（F=15.88, p<0.001），突触后致密物厚度显著变薄（F=90.68, p<0.001），突触间隙宽度增加（F=21.71, p<0.001）。ENA组突触损伤较轻，结构清晰完整，突触小泡增多，突触数量显著增多，突触后致密物增厚，突触间隙变窄。

**ENA增强CSD大鼠海马DG区树突棘密度和蘑菇状棘密度**：Golgi染色显示，TC组树突棘以成熟形态（蘑菇状和短粗状）为主。Mod组和假ENA组树突棘呈未成熟状态（细长或丝状伪足），总树突棘密度（F=41.33, p<0.001）和蘑菇状树突棘密度（F=10.04, p=0.004）显著降低。ENA组树突棘更成熟，总密度和蘑菇状棘密度显著增加，表明ENA可减轻CSD对树突棘和突触可塑性的损伤。

讨论部分总结：睡眠障碍是认知损伤的重要危险因素，急性失眠可逆，但慢性睡眠剥夺导致进行性高级认知功能下降，目前药物干预效果有限。ENA通过刺激风池和供血两穴，调节经络气血，现代解剖学证实其深部受脊髓感觉神经纤维和椎动脉支配，可传递信号至脑干网状结构，调节额叶和海马等脑区功能。行为学结果证实ENA有效改善CSD诱导的神经认知缺陷。CSD激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，升高皮质酮水平，既往研究显示ENA可下调皮质酮并促进正常睡眠周期恢复。海马齿状回是成年海马神经发生（adult hippocampal neurogenesis, AHN）的主要部位，Ki-67标记细胞增殖，DCX标记神经元分化，本研究发现ENA上调两者表达，促进神经发生。突触可塑性是记忆存储的主要功能机制，CSD减少树突棘和活动依赖蛋白表达，本研究中ENA治疗减轻了神经元和突触的病理改变，增加突触密度和蘑菇状棘密度，提示ENA通过恢复突触可塑性重建记忆网络。本研究的局限性：仅使用雄性大鼠，未纳入雌性样本；缺乏CSD后即刻基线对照，无法完全排除自然恢复的可能性；组织学和超微结构分析样本量较小（每组3只）。未来研究应包括更大样本量、雌性动物以及不同恢复期。结论部分翻译：在雄性Wistar大鼠中，ENA通过上调DCX和Ki-67蛋白表达，促进海马神经发生中神经干细胞的增殖和分化，减轻神经元和突触可塑性损伤，改善神经认知功能。然而，ENA调节神经发生和突触可塑性的分子机制尚不明确，且仅使用雄性大鼠限制了研究结果的普适性。探索ENA在成年海马神经发生过程中的分子靶点并纳入雌性动物模型将是未来研究的重点。