《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Fungal extracellular vesicles as biomarkers in candidiasis: biogenesis, virulence, and CNS diagnostic applications
编辑推荐：
侵入性念珠菌病仍然是一种危及生命的感染，死亡率高达40-55%，但目前的金标准诊断方法（如血培养）通常缓慢且不敏感。本综述评估了真菌细胞外囊泡（EVs）作为发病机制的驱动因素和作为生物标志物的临床效用。研究人员首先概述了EVs的生物发生和跨真菌细胞壁的转运，强
侵入性念珠菌病仍然是一种危及生命的感染，死亡率高达40-55%，但目前的金标准诊断方法（如血培养）通常缓慢且不敏感。本综述评估了真菌细胞外囊泡（EVs）作为发病机制的驱动因素和作为生物标志物的临床效用。研究人员首先概述了EVs的生物发生和跨真菌细胞壁的转运，强调了膨压和酶重塑的作用。然后讨论了EVs如何作为毒力因子（如candidalysin和Als3）的保护性载体，调节组织侵袭和宿主反应。虽然分析这些循环中的真菌EVs为系统性侵入性念珠菌病提供了一个有前景且敏感的窗口，但在中枢神经系统（CNS）受累的情况下，这种方法面临独特的障碍。在CNS中，真菌信号被隔离在血脑屏障（BBB）之后，并被大量的外周EVs严重稀释，使得总血浆分析不充分。为了克服这些障碍，研究人员提出了一种专门的诊断框架，结合了神经元来源EVs（NDEVs）的双标记免疫捕获（使用神经细胞粘附分子（NCAM）和细胞间粘附分子5（ICAM-5））以及内部念珠菌相关货物的检测。研究人员强调，虽然这种宿主囊泡富集策略在机制上是合理的，但在作为早期CNS诊断的非侵入性平台部署之前，需要标准化的分离工作流程和前瞻性临床验证。
**2 真菌EV生物发生与“大逃亡”**
真菌细胞外囊泡（EVs）是由脂质双层构成的球形颗粒，代表了生命三域中通用的分泌机制。在真菌学领域，自2007年首次在新生隐球菌（*Cryptococcus neoformans*）中描述以来，其存在已在至少15个真菌属中得到确认。尽管真菌EVs的精确生物发生途径尚未完全阐明，但推测其遵循类似哺乳动物的两种主要路线：微囊泡途径（从质膜直接向外出芽）和外泌体途径（多泡体（MVBs）与质膜融合释放腔内囊泡）。对驱动这些途径的分子机制的基础洞察主要来自两个代表性模型：非致病性酵母酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）和机会性病原体新生隐球菌。例如，高尔基体相关调控因子（如新生隐球菌的Sec6和酿酒酵母的Sec4）直接参与囊泡释放和货物分选。同时，转运所需内体分选复合物（ESCRT）的组分通过MVB形成调控真菌EVs的分泌水平，影响EV货物组成和生物膜相关耐药性。
真菌细胞壁曾被认为是对膜结合EVs逃逸至胞外空间的坚固物理屏障，但近期研究表明，细胞壁并非静态刚性结构，而是具有“粘弹性”的基质，能响应外界刺激和内部膨压。关于EVs如何穿越该屏障，提出了三种主要假说：第一，膨压产生的物理力可能推动囊泡通过细胞壁内的微孔；第二，EVs携带的细胞壁重塑酶（如葡聚糖合酶亚基Fks1和几丁质合酶Chs3）可局部修饰细胞壁以促进囊泡通过；第三，具有肌球蛋白样结构域的几丁质合酶以及与EVs相关的肌球蛋白相关蛋白可能驱动囊泡跨壁转运。这一跨壁转运机制首先在新生隐球菌中被描述，可比喻为真菌大分子跨越细胞壁的“大逃亡”，随后扩展到其他病原真菌，如白色念珠菌（*Candida albicans*），其中EVs同样作为毒力相关货物的递送载体。
**3 白色念珠菌中EV介导的毒力因子转运**
在白色念珠菌中，EVs通过选择性包装和转运多种毒力因子，成为致病性的关键载体。其中，成孔毒素candidalysin发挥核心作用。尽管candidalysin也通过常规分泌途径以可溶性毒素形式大量释放，但其囊泡包裹作为一种精密的补充递送模式，仅在直接接触宿主细胞表面时保留肽的免疫刺激和膜穿孔能力。此外，白色念珠菌EVs携带更广泛的蛋白质组学特征，包括分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）家族成员，这些蛋白在胞外环境中作为关键效应因子。
除candidalysin外，白色念珠菌EVs的货物库还包括具有不同免疫调节功能的其他效应因子。在鼠结肠炎模型中，富含质膜ATP酶1（Pma1）的EVs足以加重肠道炎症，激活树突状细胞，并以含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集结构域蛋白9（CARD9）依赖方式促进T辅助细胞17（Th17）分化。这些发现共同确立了白色念珠菌EVs作为宿主免疫的主动调节因子，其形态和背景依赖的货物组成不仅反映病原体的毒力状态，还提示EV分子图谱可作为感染的信息指纹，对后续诊断应用具有直接意义。
**4 真菌细胞外囊泡的诊断应用**
侵入性念珠菌病的临床管理因当前诊断工具的不足而受到严重限制。血培养作为金标准，敏感性欠佳（在确诊案例中高达50%无法检出），且需48-72小时延迟。辅助性非培养检测（如血清（1,3）-β-D-葡聚糖、甘露聚糖/抗甘露聚糖抗体、PCR检测板和基于T2磁共振（T2MR）的T2Candida检测板）虽周转更快，但存在交叉反应、物种敏感性差异及无法区分活动性感染与定植等局限。关键的是，这些平台均无法有效应用于中枢神经系统（CNS）感染，其中生物标志物信号被血脑屏障（BBB）进一步衰减。正是这些未满足的临床需求，使循环真菌EVs成为有望提供实时、高特异性信息的诊断替代方案。
利用念珠菌EVs的诊断潜力需全面理解其分子组成，这已通过高分辨率蛋白质组学和转录组学得到加速。比较蛋白质组学分析揭示，白色念珠菌EVs携带形态依赖的毒力指纹，其货物组成随病原体生长状态动态变化。例如，分泌型天冬氨酸蛋白酶Sap4-6在菌丝EVs中选择性富集，与活跃的组织侵袭相关；而酵母型EVs则优先包装Sap3及糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定亚型Sap7、Sap9和Sap10。菌丝囊泡同样富集其他组织侵袭性效应因子，如粘附素Als3和溶细胞肽candidalysin。这些独特的蛋白质组学图谱提供了候选生物标志物，如Sap2、Sap4-6、Als3和（1,3）-β-葡聚糖转移酶Bgl2p（Bgl2），可直接反映病原体的活跃毒力状态。
除蛋白质外，EVs还捕获多种RNA物种，包括mRNA和小非编码RNA，这些RNA受到保护免受胞外RNase降解。在白色念珠菌和耳念珠菌（*Candida auris*）中，tRNA衍生片段（tRFs）高度丰富，但更广泛的RNA图谱产生物种分辨的分子标准，可清晰区分两者。例如，snoRNA在白色念珠菌EVs中显著富集，而在耳念珠菌中缺失。其他非白念珠菌物种也表现出独特的EV特征：光滑念珠菌（*Candida glabrata*）表达GPI锚定的Epa家族粘附素，并缺乏分泌型Sap蛋白酶；海氏念珠菌（*Candida haemulonii*）EVs携带与代谢适应和固有耐药性相关的蛋白（如BMH1、TEF1、CDC19、PDC11）。整合这些物种特异性蛋白质和RNA货物，可构建支持稳健、非培养物种鉴定的双层分子架构。
然而，将这些分子指纹转化为临床检测面临技术瓶颈：分离效率和复杂样本中的敏感性。临床样本中宿主来源囊泡的压倒性背景使真菌信号回收困难。例如，从念珠菌病、隐球菌病和副球孢子菌病患者血清和尿液中分离的EVs含有真菌和宿主来源的代谢物，其中麦角固醇（真菌特异性固醇）被提议作为潜在鉴别标志物，但其检测需敏感质谱方法。区分真正的真菌EV货物与共分离的非囊泡污染物仍具挑战。为克服这一障碍，未来临床工作流程需利用真菌特异性表面分子清除宿主背景，再检测内部毒力货物。定量蛋白质组学已鉴定出claudin样Sur7家族蛋白（包括Sur7和胞外囊泡蛋白1（Evp1）），这些蛋白在白色念珠菌酵母和生物膜来源EVs表面一致展示，成为物种偏向免疫亲和捕获的理想靶标。同时，EV递送的质子泵Pma1可提供活动性黏膜感染和体内免疫激活的功能读数。一个两步诊断平台可先使用抗Sur7/Evp1或抗真菌聚糖抗体分离白色念珠菌EV群体，随后定量检测该富集组分中的特异性内部货物（如Pma1或candidalysin），从而保障检测特异性。
**5 推进中枢神经系统诊断：从病原体特征到宿主来源的NDEV策略**
循环真菌EVs的分离和分析为系统性侵入性念珠菌病提供了有前景的窗口，但在涉及CNS的病例中达到显著功能极限。在系统性念珠菌血症中，真菌特征直接释放入血流，可使用真菌特异性标志物（如Sur7/Evp1）有效捕获。然而，CNS念珠菌病仍是一个独特的诊断难题，因为真菌信号被隔离在BBB和血-脑脊液屏障（BCSFB）之后，逃逸至外周的任何信号都被大量系统性EVs严重稀释。
为应对这些障碍，需理解神经侵袭机制。白色念珠菌主要通过真菌侵袭素（如Als3和Ssa1）介导的BBB跨细胞胞吞作用以及BCSFB的菌丝穿透到达CNS。一旦感染在脑内建立，由于稀释效应，在外周循环中检测这些信号变得困难。神经元来源的囊泡仅占血浆总EVs池的一小部分，CNS起源的特征常被外周生物噪声掩盖。
因此，研究人员提出将诊断焦点从自由漂浮的真菌EVs转向宿主来源的神经元来源EVs（NDEVs），作为CNS特异性信号的优越替代方案。尽管该接力策略在念珠菌病中尚未经实验证实，但基于其他细胞内病原体研究的先例，在科学上具有基础。例如，在结核病中，暴露于分枝杆菌蛋白的宿主巨噬细胞释放携带这些病原体特征的外泌体。由此推测，经小胶质细胞（CNS驻留吞噬细胞）加工的真菌货物通过双向胶质-神经元EV交换转移至神经元，随后释放入血。这种接力机制提示NDEVs可作为高浓度胶囊，捕获原本无法检测的CNS起源真菌货物。
该策略的可行性得到已有神经元表面标志物的支持。早期依赖L1细胞粘附分子（L1CAM）的方法因血浆中可溶性非囊泡成分的存在而受到批评。使用NCAM和ICAM-5的双标记方法为选择性NDEV富集提供了有前景的替代方案：NCAM在脑区广泛表达且与EV表面相关，而端脑限制性ICAM-5提供所需的神经元特异性以清除外周噪声。最终，将NDEV捕获标志物与高分辨率真菌EV分离技术（如抗Sur7/Evp1平台）整合，有望从NDEV内部回收候选脑源信号（如candidalysin或菌丝特异性转录本ECE1、ALS3），尽管这些货物整合进宿主NDEVs仍需实验证明。通过结合宿主囊泡富集与病原体特异性货物检测，该多重框架为CNS念珠菌病的早期诊断和监测提供了一个概念性非侵入平台。
**6 真菌EV标准化面临的挑战**
将本综述提出的EV诊断框架转化为临床实践的一个主要障碍是缺乏EV分离、表征和功能验证的标准化方案。与哺乳动物EV研究不同，真菌EV研究面临独特的技术难题，阻碍了跨研究比较和可重复性。许多真菌EV研究历史上依赖基础差速超速离心法，该方法常共分离非囊泡胞外颗粒（NVEPs），如蛋白聚集体、多糖复合物和脂蛋白，使生物学效应难以归因于EVs。缺乏统一报告标准导致因培养条件和分离方案差异而相互矛盾的结果，细胞外囊泡研究最低信息2023（MISEV 2023）指南明确要求透明记录所有实验变量以解决该问题。
此外，真菌细胞壁构成的独特物理障碍：β-葡聚糖、甘露聚糖和几丁质组成的致密多糖基质可在培养和分离过程中脱落碎片，污染制备物并混淆下游蛋白质组学和脂质组学分析。EVs穿越该刚性屏障的机制尚不完全清楚，引发对体外分离条件是否忠实再现体内囊泡释放的疑问。与哺乳动物EVs可通过四跨膜蛋白标志物（CD9、CD63、CD81）鉴定不同，真菌EVs尚未建立通用分子标志物，尽管白色念珠菌中claudin样Sur7家族蛋白和Evp1等物种特异性候选物显示出前景。
分析前变量（如血浆采集管、冻融循环和抗凝剂选择）已知会严重影响EV产量和蛋白质组成，因此必须在部署前制定统一处理方案。最终，本诊断方案要求检测已极微小NDEV组分中的低丰度念珠菌相关货物，对检测灵敏度和宿主背景噪声的严格表征提出严苛要求。尽管近期真菌EV研究已开始采用MISEV 2023推荐的正式表征框架，但更广泛的采用仍有限，尤其是在资源受限环境中缺乏冷冻电镜和高分辨率质谱。
**7 基于EV的诊断与治疗潜力展望**
本综述提出框架的即时转化优先事项在于严格的临床验证。核心前提（念珠菌来源分子特征可从外周NDEVs中回收）需使用确诊CNS念珠菌病患者的临床标本进行直接实验确认。同样重要的是，将该NCAM和ICAM-5免疫捕获流程与既定诊断标准（如血清（1,3）-β-D-葡聚糖检测、PCR检测板和CSF培养）进行综合基准测试，以确定其在敏感性和周转时间方面是否提供真正诊断优势。随着这些表征工作流程的成熟，整合多重蛋白质组学、转录组学和脂质组学EV分析可实现病原体毒力状态的实时纵向监测。原则上，该液体活检框架也可适用于其他神经侵袭性真菌病原体（如隐球菌和曲霉菌），从而将宿主来源EV富集的临床实用性扩展到念珠菌感染之外。
展望未来，对真菌EV生物学的深入认识自然开辟了创新的治疗视野。针对囊泡介导运输的干预措施可破坏关键毒力因子的递送并减轻生物膜相关耐药性。例如，ESCRT机制组分和特定细胞壁重塑酶可能成为药物靶点，以损害EV生物发生和跨壁转运。然而，由于关键毒素（如candidalysin和Sap家族成员）也通过常规分泌途径大量释放为可溶性效应因子，仅针对EV途径的策略必须被视为辅助性手段。这些囊泡靶向干预能否在不损害宿主细胞活力的前提下实现有意义的治疗效果，仍是一个有待遗传学和药理学深入剖析的问题。最终，通过统一宿主来源诊断富集与靶向病原体拦截策略，真菌EV生物学为重塑顽固性侵袭性真菌病的治疗提供了综合工具包。
