基于模块化代谢工程的大肠杆菌中1,4-丁二胺生物合成的增强与平衡

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Enhancement and balance of 1,4-butanediamine biosynthesis in Escherichia coli based on modular metabolic engineering

　　

1,4-丁二胺（1,4-butanediamine）是合成工程塑料（如聚酰胺46（Polyamide 46））的重要原料，具有优异性能，广泛应用于汽车、电子和机械制造行业。在本研究中，研究人员采用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)作为起始菌株，利用模块化策略系统改造1,4-丁二胺生物合成途径。将1,4-丁二胺生物合成重新划分为两个模块：1,4-丁二胺（1,4-butanediamine）生产模块和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid）生产模块。通过控制基因pykF、ppc、aceEF、gltA、icdA、gdhA、argD、argCB、argJ、ODC10的表达强度，获得重组1,4-丁二胺生产菌株PKT，实现了862.82 mg/L的1,4-丁二胺产量，相较于大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)提高了8.62倍。随后，对PKT菌株的发酵培养基进行了优化。发酵24小时后，1,4-丁二胺产量达到1843.60 mg/L，较原始菌株提高了16.23倍。此外，研究人员采用非靶向代谢组学（non-target metabolomics）分析重组菌株PKT高效合成1,4-丁二胺过程中代谢物的变化。结果显示，共检测到653个差异代谢物。差异代谢物通路分析表明，1,4-丁二胺合成途径中有9个差异代谢物，其中5个参与其合成途径，4个参与其降解分支。这些代谢物差异为重组菌株的改造提供了理论基础。通过微生物细胞工厂（microbial cell factories）发酵实现1,4-丁二胺的绿色生产是未来的方向。本研究为构建高产1,4-丁二胺工程菌株提供了理论指导。

### 论文解读：基于模块化代谢工程的大肠杆菌1,4-丁二胺生物合成增强与平衡

#### 研究背景与问题
1,4-丁二胺（1,4-butanediamine，又称腐胺）是合成聚酰胺46（PA46）、PA410等高性能工程塑料的关键原料，广泛应用于汽车、电子和机械制造领域。目前，1,4-丁二胺的合成主要依赖化学法，但该方法以不可再生的石油化工原料为基础，面临可持续性差和环保压力大的问题。因此，开发绿色、环保的生物合成方法至关重要。生物合成途径主要包括微生物发酵和酶转化法，但酶转化法依赖昂贵的底物（如精氨酸或鸟氨酸），成本高且不经济。微生物发酵法可通过优化代谢途径和发酵工艺提高产量，并以葡萄糖等低成本底物为原料。然而，在传统代谢工程中，单独优化单个步骤可能导致代谢通量失衡：过度表达某一酶可能造成下游瓶颈，而删除竞争分支可能破坏其他部位的通量分布，进而引发反馈抑制、副产物积累甚至细胞生长受损。为解决这一问题，研究人员引入模块化代谢工程策略，将相关反应分组为功能模块（如前体供应和产物合成），使各模块可独立调节并维持整体途径协调。

#### 研究内容与结论
本研究以大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)为起始菌株，采用模块化代谢工程策略系统改造1,4-丁二胺生物合成途径。研究人员将整个途径重新划分为两个模块：1,4-丁二胺生产模块（模块1）和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid）生产模块（模块2）。通过调控关键基因的表达强度，获得重组菌株PKT，实现了1,4-丁二胺产量的显著提升。经发酵培养基优化后，产量进一步增加。此外，通过非靶向代谢组学分析揭示了代谢物变化，为后续菌株改造提供了理论依据。该研究证明了模块化策略在平衡代谢通量、提高目标产物产量方面的有效性，为构建高产1,4-丁二胺工程菌株提供了理论指导。论文发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。

#### 主要技术方法
研究人员采用以下关键方法：1）模块化代谢工程策略：将1,4-丁二胺合成途径分为1,4-丁二胺生产模块和α-酮戊二酸生产模块，每个模块独立设计并调节表达强度。2）基因过表达与质粒构建：使用不同拷贝数质粒（pRSM3、pETM6、pCDM4、pCOM4、pACM4）调控基因表达，通过同尾酶法构建串联表达载体。相关基因源自大肠杆菌MG1655和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）13032。3）发酵优化：比较TB培养基和R/2培养基，并添加葡萄糖、硫酸铵、酵母提取物和蛋白胨，在2 L摇瓶中进行发酵。4）非靶向代谢组学分析（non-target metabolomics）：采用液相色谱-质谱（LC-MS）技术检测菌株胞内代谢物，结合主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行差异代谢物筛选和KEGG通路富集分析。

#### 研究结果

**3.1. 1,4-丁二胺模块化合成途径的系统改造**
研究人员将1,4-丁二胺合成途径重新定义为两个模块。通过单基因过表达和串联基因过表达，分别优化各模块。

- **3.1.1. 1,4-丁二胺生产模块的代谢改造**：过表达gdhA、argD、argCB、argJ*（来自谷氨酸棒杆菌的密码子优化基因）和ODC10（来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）的鸟氨酸脱羧酶）基因。单基因过表达中，ODC10过表达效果最显著，产量提高2.23倍。串联表达五个基因（P4菌株）产量提高2.45倍；进一步共表达ODC10（T1菌株）产量提高6.87倍，表明鸟氨酸脱羧酶是关键限速步骤。

- **3.1.2. α-酮戊二酸生产模块的代谢改造**：过表达pykF、ppc、aceEF、gltA、icdA基因。单基因过表达中，aceEF过表达效果最佳，产量提高1.28倍。串联表达五个基因（K5菌株）产量提高1.62倍，表明该模块能有效将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为α-酮戊二酸。

- **3.1.3. 两种不同生产模块的质粒拷贝数**：通过不同拷贝数质粒（pRSM3约100拷贝、pETM6 40拷贝、pCDM4 20-40拷贝、pCOM4 20-40拷贝、pACM4 10-12拷贝）调节模块强度。1,4-丁二胺生产模块中，中等拷贝数质粒pCOM4（P8菌株）产量最高，提高2.54倍；α-酮戊二酸生产模块中，低拷贝数质粒pACM4（K13菌株）产量最高，提高2.06倍。

- **3.1.4. 不同模块在1,4-丁二胺生物合成中的兼容性**：将两模块按18种组合共表达，发现最优组合为1,4-丁二胺生产模块（高拷贝，约100）与α-酮戊二酸生产模块（低拷贝，10-12），菌株PK3产量达539.22 mg/L，提高7.63倍。

- **3.1.5. PKT菌株构建**：在PK3菌株基础上进一步过表达ODC10，获得PKT菌株，产量达862.82 mg/L，较BL21(DE3)提高8.62倍。

**3.2. PKT菌株发酵优化**
将培养基从TB更换为R/2培养基（含10 g/L葡萄糖和3 g/L硫酸铵），并添加5 g/L酵母提取物和1 g/L蛋白胨，产量提升至1,288.01 mg/L。在2 L摇瓶发酵中，24小时后产量达1,843.60 mg/L，较原始菌株提高16.23倍。

**3.3. 代谢组学分析结果**

- **3.3.1. 代谢物差异分析**：采用非靶向代谢组学分析PKT与BL21(DE3)在24小时发酵后的胞内代谢物。PCA、PLS-DA和OPLS-DA模型显示两组样本显著分离，模型稳定可靠。

- **3.3.2. 差异代谢物筛选**：共检测到653个差异代谢物，其中428个上调，225个下调。火山图显示显著差异代谢物。VIP值排名前10的代谢物包括1,5-萘二胺、组胺、吲哚-3-丙烯酸等，均显著上调，表明代谢流向这些物质，可能限制1,4-丁二胺合成。

- **3.3.3. KEGG通路富集分析**：差异代谢物主要富集在代谢通路和嘌呤代谢等途径。将差异代谢物映射至1,4-丁二胺合成途径，发现9个差异代谢物，其中5个参与合成途径（2-磷酸甘油酸、乙酰辅酶A、柠檬酸、胍基丁胺、N-乙酰鸟氨酸），4个参与降解分支（谷氨酰胺、脯氨酸、N-乙酰氨基丁酸、4-氨基丁酸）。这些积累表明代谢瓶颈和分支通量分流，为后续基因改造（如过表达eno、acnA、argE、speB，或敲除glnA、speG，弱化proB）提供了靶点。

#### 讨论与结论
讨论部分指出，本研究通过模块化代谢工程有效提高了1,4-丁二胺产量，代谢组学数据揭示了具体改造靶点。未来的研究方向包括增强NADPH供应、采用多顺反子构建或基因组整合以提高遗传稳定性，以及采用补料分批发酵（fed-batch fermentation）以提升细胞密度和产物积累。结论部分翻译如下：本研究提出了一种模块化方法，系统改造起始菌株大肠杆菌BL21(DE3)中的1,4-丁二胺生物合成途径。将该途径分为1,4-丁二胺生产模块和α-酮戊二酸生产模块，从而构建了重组1,4-丁二胺生产菌株PKT。通过调控基因pykF、ppc、aceEF、gltA、icdA、gdhA、argD、argCB、argJ*和ODC10的表达水平，1,4-丁二胺产量达到862.82 mg/L，较起始菌株提高8.62倍。优化PKT菌株的发酵培养基后，24小时发酵产量达到1,843.60 mg/L，较原始菌株提高16.23倍。非靶向代谢组学分析鉴定出653个差异代谢物，其中428个上调，225个下调。通路分析显示1,4-丁二胺合成途径中有9个差异代谢物，其中4个与1,4-丁二胺合成相关，5个与其降解分支相关。这些代谢差异为菌株改造奠定了基础，指导了高产1,4-丁二胺工程菌株的开发。本研究为构建高产1,4-丁二胺工程菌株提供了理论指导。