病毒性脑脊髓炎期间，源自生发中心的B细胞向中枢神经系统的迁移时间

《Journal of Neuroimmunology》：Migration timeframe of germinal center-derived B cells to the central nervous system during viral encephalomyelitis

　　

• •
  在生发中心形成的早期，GC印记的B细胞会向中枢神经系统迁移。
• •
  随着持续存在的病毒数量减少，B细胞向中枢神经系统的迁移也会减少，这一过程与脱髓鞘无关。
• •
  ASCs和记忆B细胞会聚集在发生脱髓鞘的病灶处。
• •
  即使迁移停止后，早期由生发中心产生的ASCs仍会留在中枢神经系统中。

引言

中枢神经系统的急性和持续性病毒感染，其临床特征为脑脊液中存在病毒特异性抗体，这些抗体可作为诊断标志物（Owens等人，2011；Gilden等人，1998）。虽然来自骨髓中的ASC所产生的血清抗体能够防止病毒扩散，但真正对局部免疫保护起关键作用的是驻留在中枢神经系统中的ASC（Wellford等人，2022；Marques等人，2011；Cardani-Boulton等人，2022；Merder和Moseman，2025；Lin等人，1999；Mutnal等人，2012）。在实验性病毒性脑炎模型中，局部产生的抗病毒抗体对于控制病毒以及防止病毒在中枢神经系统再次活跃至关重要（Cardani-Boulton等人，2022；Griffin，2010），这一现象也印证了中枢神经系统中存在病毒特异性抗体与临床上的保护作用之间的关联（Günther等人，1997；Puccioni-Sohler等人，1999）。然而，包括IgD⁺ IgM⁺、IgM⁺以及IgG⁺ B细胞在内的其他B细胞亚群也会迁移到发炎的中央神经系统（Phares等人，2014；Metcalf等人，2013；DiSano等人，2019），它们在维持局部保护性体液免疫中的作用至今仍不完全清楚。

在多发性硬化症这类脱髓鞘疾病患者的中枢神经系统中，鞘内B细胞也被证实是脑脊液中出现寡克隆免疫球蛋白条带的来源。不过在多发性硬化症中，B细胞被认为具有致病性，其作用不仅限于分泌抗体，因为那些能够清除CD20⁺ B细胞的靶向疗法也显示出疗效，而这些B细胞包括初始B细胞、记忆B细胞，但不包括ASC（Sabatino等人，2019；Cencioni等人，2021）。此外，B细胞与CD4 T细胞在脑膜及血管周围的聚集，与持续的局部免疫激活以及邻近脑区的脱髓鞘现象有关（Cencioni等人，2021；Jain和Yong，2022）。另外，爱泼斯坦-巴尔病毒感染作为导致B细胞异常聚集于中枢神经系统的致病因素，也受到了很多研究关注（Soldan和Lieberman，2023；L?derach等人，2025）。B细胞在中枢神经系统中的积累在病毒反应时具有保护作用，但在自身免疫性疾病中则具有致病性，这一现象凸显出了解析中枢神经系统中不同B细胞亚群的激活、迁移、定位以及存活机制的临床重要性。

在多种病毒性脑脊髓炎模型中，虽然可以在受感染的中枢神经系统中检测到多种B细胞亚群，但目前还没有证据表明存在能够支持局部分化的异位滤泡样结构（Phares等人，2014；DiSano等人，2019；Metcalf和Griffin，2011；DiSano等人，2017）。动力学研究显示，B细胞在中枢神经系统中的积累之前，其激活和分化已经先在引流的颈部淋巴结中发生，这说明颈部淋巴结中的生发中心是向中枢神经系统输送病毒特异性B细胞的源头（Phares等人，2014；DiSano等人，2017；Atkinson等人，2019；Atkinson和Bergmann，2017）。这一观点还得到了以下事实的支持：在颈部淋巴结中，病毒特异性ASC的出现频率高于中枢神经系统中的出现频率（Atkinson和Bergmann，2017）。在生发中心内，抗原激活的B细胞会经历免疫球蛋白类别转换以及体细胞高频突变，从而实现抗体亲和力的成熟，这一过程是由活化诱导的胞苷脱氨酶的酶活性所介导的（Elsner和Shlomchik，2020；Victora和Nussenzweig，2012；Radbruch等人，2006）。那些经过体细胞高频突变和阳性选择后存活下来的生发中心B细胞，会进一步发展成记忆B细胞和ASC，随后这些细胞可以进入血液循环，再迁移到骨髓、黏膜部位以及包括中枢神经系统在内的发炎的非淋巴器官中（Cencioni等人，2021）。在中枢神经系统中几乎检测不到Aicda基因的表达，更关键的是，在源自中枢神经系统的B细胞群体中也不存在该基因的表达，这一事实表明，那些经历过生发中心发育的B细胞是迁移到中枢神经系统而非在本地分化的（Phares等人，2014；Atkinson等人，2019）。在小鼠冠状病毒引起的脑脊髓炎模型中，病毒特异性ASC即使在感染后3个月仍然存在于中枢神经系统中，它们对于防止由持续存在的病毒RNA引发的病毒再度活跃至关重要（Marques等人，2011；Tschen等人，2006）。在生发中心形成功能受损的小鼠中，中枢神经系统内的病毒特异性ASC数量显著减少，这也意味着病毒控制能力下降，这一现象进一步强调了病毒激活的生发中心在将具有保护作用的B细胞引导至中枢神经系统方面的关键作用（Atkinson和Bergmann，2017）。我们还利用AID-CreERT2:Rosa26loxP-tdTomato（AID-tdTomato）报告基因小鼠分析了mCoV感染后的AID表达B细胞，这类小鼠在Aicda基因启动子的调控下表达一种可通过他莫昔芬诱导的Cre蛋白，从而实现对表达AID的细胞进行不可逆的标记（Dogan等人，2009；Le Gallou等人，2018）。这些研究显示，在整个感染期间都给予他莫昔芬处理的情况下，感染后28天时，脊髓中的大多数CD138⁺ ASC以及近50%的IgD^? CD138^? B细胞都表现出tdTomato基因的表达，这一现象表明这些细胞来源于生发中心（Atkinson等人，2019）。不过，由于病毒诱导的生发中心可以长时间存在，目前还不清楚tdTomato基因标记会持续多久，以及源自生发中心的B细胞会持续向长期受感染的中枢神经系统迁移多长时间。此外，也尚未研究过随着时间推移，新招募的tdTomato⁺细胞在脊髓中的定位是否存在差异。

本研究利用冠状病毒脑脊髓炎模型，旨在确定病毒特异性、经历过体细胞高频突变的tdTomato⁺ B细胞向中枢神经系统迁移的时间节点，以及它们一旦进入中枢神经系统后的命运。在冠状病毒感染后，通过对AID-tdTomato小鼠每隔一周给予一次他莫昔芬处理，我们发现颈部淋巴结中的tdTomato⁺ B细胞在感染后35天内都会被标记，而中枢神经系统中的B细胞则主要是在感染后21天之前被标记的。此外，感染后21天后，中枢神经系统中的病毒特异性抗体的亲和力并未上升，这一现象说明在感染后21天之后，仅有少量经历了进一步体细胞高频突变的B细胞被招募进入中枢神经系统。在脊髓中，tdTomato⁺ B细胞仅聚集在脱髓鞘的病灶处，但随着时间的推移，它们在正常脑组织中的分布逐渐消失。总体而言，这些数据表明，新分化出的生发中心B细胞向中枢神经系统损伤部位迁移的能力主要局限于那些来自早期生发中心的细胞。不过，尽管随着病毒RNA数量的减少，tdTomato⁺ B细胞的招募和存活率都会下降，但那些在中枢神经系统中持续存在的少数ASC就足以维持长期的抗体产生。

章节要点

小鼠、病毒感染以及他莫昔芬给药

C57BL/6?J（库存编号000664）小鼠购自杰克逊实验室（位于美国缅因州巴港）。AicdaCreERT2小鼠以及Rosa26loxp-tdTomato小鼠分别由Claude-Agnes Reynaud（法国巴黎INSERM机构）和Dimitrios Davalos（美国克利夫兰诊所基金会）提供（Dogan等人，2009）。生成AID-tdTomato小鼠的交叉育种方法此前已有报道（Atkinson等人，2019）。这些小鼠的饲养条件为

病毒持续存在期间生发中心B细胞体细胞高频突变及迁移的动力学特征

由于在病毒持续存在期间，病毒特异性ASC会留在中枢神经系统中以防止病毒再度活跃，因此我们利用AID-tdTomato小鼠，试图确定在生发中心反应持续存在的整个过程中，经历过体细胞高频突变的B细胞何时会迁移到持续受感染的中枢神经系统。从感染后第14天、21天或28天开始，每隔一天给予他莫昔芬处理，持续一周，以此在那些在指定时间内正在转录Aicda基因的B细胞中诱导tdTomato基因的表达（见图1A）

讨论

在感染性病毒已被检测不到且病毒mRNA水平也下降之后，病毒特异性B细胞仍会在持续感染小鼠的脊髓中存活数月之久（Phares等人，2014；Tschen等人，2006）。然而，关于从外周组织向持续受感染的中枢神经系统持续招募B细胞的时机，目前相关研究还十分有限。借助能够同时标记未被激活的非生发中心B细胞和源自生发中心的B细胞的AID-tdTomato报告基因小鼠，以及分阶段给予他莫昔芬的处理方案，我们的研究结果表明

CRediT作者贡献说明

Volodymyr Stetsenko：论文撰写——初稿撰写，可视化分析，结果验证，研究方法设计，正式数据分析，数据整理，概念构建。Amber Cardani Boulton：论文撰写——初稿撰写，可视化分析，结果验证，研究方法设计，实验研究实施，正式数据分析，数据整理，概念构建。Rikardo Gogaj：可视化分析，结果验证，数据整理。Cornelia C. Bergmann：论文撰写——初稿撰写，可视化分析，结果验证，研究资源协调，项目管理工作管理，研究方法设计，实验研究实施，资金筹集工作

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

Volodymyr Stetsenko|Amber Cardani Boulton|Rikardo Gogaj|Cornelia C. Bergmann