累积转录因子结合和p300介导的组蛋白乙酰化驱动增强子激活频率

《Nature Genetics》：Cumulative transcription factor binding and p300-mediated histone acetylation drive enhancer activation frequency

　　

在真核生物中，转录因子（transcription factors, TFs）必须持续与核小体竞争以接近其结合位点，导致调控区域染色质可及性的细胞间变异性。尽管这对于理解转录中增强子功能至关重要，但定义增强子在细胞群体中激活频率的机制仍不清楚。研究人员使用单分子足迹法（single-molecule footprinting, SMF）来量化增强子处染色质可及性的频率，以响应TF扰动及其染色质环境的变化。研究发现，单独来看，大多数TFs在少数细胞中打开染色质，而累积的TF结合控制着增强子激活频率。此外，测试数百个增强子插入异位基因组位置时的功能表明，p300活性对于其完全激活是必需的。研究数据支持一个模型，其中增强子激活频率依赖于多个TFs的累积功能，并由p300活性调节。

**论文解读：累积转录因子结合与p300介导的组蛋白乙酰化驱动增强子激活频率**

**研究背景与问题**
在真核生物转录调控中，顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）如增强子和启动子的激活依赖于转录因子（transcription factors, TFs）与核小体的持续竞争。这一竞争导致染色质可及性（chromatin accessibility, CA）在细胞群体中存在异质性，即同一CRE在不同细胞中开放状态不同。然而，决定增强子激活频率——即细胞群体中增强子处于开放状态的比例——的分子机制尚不明确。现有模型包括“先驱因子”模型（特定TF专门打开染色质）和累积模型（多个TF协同作用），但缺乏系统性定量证据。此外，染色质环境（如组蛋白修饰）如何影响TF结合和CA频率也是未解问题。因此，研究人员旨在量化CA频率，解析单个TF贡献、累积效应、染色质环境及p300介导的乙酰化在其中的作用。

**研究内容与结论**
该研究通过单分子足迹法（SMF）结合多种遗传扰动系统，系统分析了小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, mESCs）中增强子激活频率的调控机制。主要结论包括：大多数增强子的CA频率低于50%，且由多个TF的累积结合而非单个TF决定；p300介导的组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）可进一步增强CA频率；CA频率直接影响RNA聚合酶II（Pol II）的招募水平，从而调控增强子活性。这些发现支持一个模型：增强子激活频率依赖于多个TFs的累积功能，并由p300活性调节。论文发表在《Nature Genetics》。

**主要技术方法**
1. **单分子足迹法（SMF）**：利用外源甲基转移酶（M.CviPI）对裸露DNA进行甲基化，结合亚硫酸氢盐测序，以单分子分辨率量化CA频率和TF足迹。
2. **FootprintCharter**：一种无监督分类器，基于DNA分子足迹宽度区分TF结合和核小体占据，用于计算CA频率和可及性宽度。
3. **多重染色质整合报告实验（MCHIRA）**：将数百个CRE片段（250 bp）通过重组酶介导的盒式交换（RMCE）插入到mESCs中性染色质环境的着陆位点，结合靶向SMF测量异位CA频率。
4. **等位基因特异性分析**：利用F1杂交系（Bl6×CAST和Bl6×SPRET）的自然遗传变异，分析单核苷酸变异（SNVs）破坏TF基序后CA频率的变化。
5. **快速降解系统（dTAG）**：通过融合FKBP12-F36V标签，添加dTAG分子诱导SOX2快速降解，评估TF缺失对CA的影响。
6. **p300抑制剂处理**：使用A-485抑制p300活性，结合ChIP–seq和SMF分析H3K27ac水平变化与CA频率的关系。
7. **精确核连续转录测序（qPRO-seq）**：测量转录活性Pol II招募水平，关联CA频率与增强子活性。
**样本队列来源**：所有实验使用mESCs，包括野生型（159系）、DNA甲基转移酶三重敲除（DNMT TKO）系、F1杂交系（Bl6×CAST和Bl6×SPRET）、SOX2-degron系及携带RMCE着陆位的TC-1系。

**研究结果**

**1. 活性增强子中频繁的核小体占据**
通过SMF和FootprintCharter分析，发现活性增强子中CA频率中位数仅为48%，且可及性宽度约150 bp，远低于启动子（>70%，180 bp）和CTCF结合位点。大部分增强子仅在<50%的细胞中开放，其中约14%的可及性来自核小体连接区长度（<100 bp），而非连续的TF结合区域。

**2. CA频率与结合TF数量相关**
分析18种TFs的ChIP–seq结合数据发现，仅有CTCF、REST、BANP、NFY和NRF1与高CA频率相关（>70%），而大多数TFs（如OCT4、SOX2）仅在22–54%的分子中关联CA。CA频率和可及性宽度随CRE上结合TF基序数量的增加而升高，表明累积结合是关键。

**3. TFs对CA的贡献是部分且累积的**
利用F1杂交系的SNVs破坏TF基序，观察到单个基序破坏导致CA频率中位数降低<10%，且效果随基序数增加而累积。SOX2快速降解实验进一步证实：完全去除SOX2后，增强子CA仅减少约10%，且含有多个SOX2基序的增强子损失更大。这支持累积模型，即每个TF贡献约10%的CA。

**4. 在异位环境中并行测量数百个增强子的CA**
通过MCHIRA将831个CRE片段插入中性染色质着陆位点，发现除CTCF外，所有TFs的异位CA频率均低于内源水平。例如，NFY和NRF1结合片段在异位达56%和67%，而内源>80%。这表明仅靠TF结合不足以完全重建内源CA，染色质环境起重要作用。

**5. 调控遗传信息仅部分决定CA频率**
对Phc3启动子（含YY1、NRF1、MYC基序）和Mitd1增强子（含5个KLF4基序）进行系统突变发现，单个基序突变导致CA部分丧失（如MYC突变损失17%，NRF1突变损失51.5%），组合突变加剧损失。这证实CA频率部分由遗传序列编码，但需额外机制达到内源水平。

**6. p300介导的乙酰化增加CA频率**
内源CA频率与H3K27ac水平正相关，而异位CA则无此关联。p300抑制剂（p300i）处理导致内源H3K27ac下降的CREs中CA频率降低，但异位插入的相同CREs不受影响。例如，Xpa增强子内源CA降低20%，异位无变化。这表明p300活性通过增加H3K27ac来增强CA频率，而异位CREs主要依赖TF结合。

**7. CA频率定义增强子处Pol II招募水平**
在F1杂交系中，等位基因特异性分析显示，CA频率降低（如因SNV破坏TF基序）导致增强子和启动子处qPRO-seq信号（代表活性Pol II）成比例下降，且增强子活性变化幅度与CA变化幅度一致。因此，CA频率直接决定增强子通过Pol II招募调控转录的频率。

**讨论与结论**
研究结果表明，增强子CA频率由多个TFs的累积活动驱动，而非依赖单个特殊因子。每个TF在约10%细胞中促进CA，支持累积模型，并补充了先驱因子模型。p300介导的乙酰化可进一步增加CA频率，但TF结合可在无乙酰化情况下发生，这为染色质环境影响增强子活性提供了分子机制。研究结论指出：增强子激活频率依赖于多个TFs的累积功能，并由p300活性调节，CA频率通过影响Pol II招募直接决定增强子活性水平。