Lkb1突变肿瘤会形成具有免疫抑制作用的髓系微环境……

《Cancer Discovery》：Lkb1-mutant tumors create an immunosuppressive myeloid nic...

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摘要

肺癌中的LKB1突变会促进免疫抑制性的肿瘤微环境形成，但其潜在机制尚不清楚。通过基因工程小鼠模型和人类肿瘤样本，我们发现LKB1缺失会导致细胞因子白血病抑制因子（LIF）的高表达，该因子通过癌细胞自身的自分泌循环，促使免疫抑制性的SiglecFHi中性粒细胞和Arg1+间质巨噬细胞侵入肿瘤组织。在Lkb1突变型肺癌肿瘤中删除LIF的受体Lifr后，我们发现自分泌的LIF信号会诱导肿瘤的可塑性，并形成Sox17+的去分化炎症细胞状态。抗体介导的LIF中和作用可选择性消除Sox17+肿瘤细胞状态，减少免疫抑制性髓系细胞，同时增强抗肿瘤T细胞反应。我们的研究揭示了驱动免疫逃逸的新型LKB1–LIF轴，并确定LIF是LKB1突变型肺癌的潜在治疗靶点。这项工作凸显了肿瘤遗传学、细胞可塑性及免疫调节在肺癌进展中的作用。

意义：LKB1突变型肺癌会表达LIF，该因子会诱导免疫抑制性的Sox17+肿瘤状态。抗LIF疗法可消除这种状态并恢复抗肿瘤免疫功能，从而揭示出这种缺乏有效靶向疗法的侵袭性癌症亚型的新脆弱性。

引言

肺腺癌的肿瘤微环境中存在着由肿瘤细胞、基质细胞以及免疫细胞构成的多种细胞类型之间的复杂相互作用。免疫细胞与癌细胞之间的互动在抑制或促进肿瘤生长方面起着关键作用。在肺部，主要的驻留免疫细胞为肺泡巨噬细胞，它们对维持肺部稳态至关重要。在损伤、感染或癌症情况下，源自骨髓的免疫细胞，包括中性粒细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞以及T细胞，会侵入肺组织。尽管在多种实体瘤中已证实增强T细胞介导的抗肿瘤免疫反应的重要性，但在癌症背景下逆转中性粒细胞和巨噬细胞免疫抑制功能的治疗策略仍不明朗。癌细胞在肿瘤微环境中面临持续的选择压力，这推动了癌细胞的进化。因此，肿瘤并非同质群体，而是以异质方式发展，通过转录重编程来适应肿瘤微环境中的各种压力。目前尚未明确肿瘤内多样性如何具体影响微环境中的免疫细胞。对于肿瘤细胞异质状态的了解有限，部分原因在于缺乏能够准确模拟人类疾病的模型。用于表征实体瘤的临床前移植肿瘤模型通常使用源自单一优势克隆的细胞系，而基于基因工程小鼠模型的自体肿瘤则能让肿瘤以异质方式发展。尽管精准医疗疗法取得了进展，肺癌仍然是最致命的癌症类型。近期研究显示，肺腺癌中常见的肝脏激酶B1（LKB1，由STK11编码）突变肿瘤属于最具侵袭性的肺癌遗传亚型之一。临床前研究已表明，LKB1突变型肿瘤具有高度炎症特性，并与免疫逃逸相关。然而，LKB1突变如何抑制免疫反应的机制仍不清楚。此外，关于这种肿瘤抑制因子如何影响肿瘤内多样性及细胞状态的研究也甚少。目前尚无针对LKB1突变型肺癌的临床获批靶向疗法，这凸显出寻找此类侵袭性遗传亚型治疗弱点的紧迫性。鉴于这些因素，LKB1突变型肿瘤成为研究肿瘤遗传学、炎症、可塑性及免疫逃逸之间相互作用的理想模型。肿瘤炎症反应虽与肿瘤发生增强有关，但其在肿瘤微环境中的治疗意义尚未得到充分探讨。在实体瘤中的先前研究已探讨过肿瘤来源的IL6如何抑制免疫监视，但目前尚无临床试验证明IL6中和疗法能改善癌症患者的预后。白血病抑制因子最近被发现有与实体瘤中的免疫逃逸相关的功能。先前的研究表明，LIF可通过作用于肿瘤相关巨噬细胞来发挥免疫抑制作用。此外，LIF还可由肿瘤微环境中的基质细胞分泌，并直接向癌细胞发送信号。不过，目前尚不清楚肿瘤来源的LIF是否可直接作用于癌细胞，以推动细胞状态转变并诱发免疫抑制性转录程序。在本研究中，我们利用基因工程小鼠模型结合体内CRISPR/Cas9编辑技术，生成具有全新特性的Lkb1突变型肺癌肿瘤，这类肿瘤能够模拟肿瘤内异质性的自然发展过程，从而揭示导致免疫逃逸的肿瘤与免疫细胞之间的相互作用。我们发现，Lkb1突变型肿瘤细胞会上调细胞因子LIF的表达，该因子通过作用于癌细胞自身的自分泌循环，诱导依赖转录因子SOX17的炎症性去分化肿瘤细胞状态。这种特定的细胞状态会重塑肿瘤微环境，使免疫抑制性的Arg1+巨噬细胞和SiglecFHi中性粒细胞增多，进而削弱T细胞介导的抗肿瘤免疫功能。

结果

Lkb1突变型肿瘤通过招募髓系细胞形成免疫抑制性微环境

为研究Lkb1突变型肺癌肿瘤对肿瘤微环境中免疫细胞的影响，我们通过气管内递送慢病毒，将携带Cre蛋白及针对Lkb1的引导RNA或非靶向对照序列的载体，注入KrasLSL-G12D/+Trp53fl/fl Rosa26LSL-Cas9-P2A-GFP/LSL-Cas9-P2A-GFP（KPC）小鼠的气道中，从而生成具有或不具有Lkb1缺失的KrasG12D/+Trp53?/?（KP）自体肿瘤（见图1A；补充图S1A）。在该模型中，携带Lkb1突变型肿瘤的小鼠相比携带Lkb1野生型肿瘤的小鼠，其肿瘤负荷更高，肿瘤分级也更严重（见补充图S1A和S1B）。为精确分析Lkb1突变型肿瘤引起的肿瘤微环境免疫重塑情况，我们在肿瘤形成11周后，对分离得到的血管外CD45+细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（见图1A；补充图S2A和S2B）。与正常（无肿瘤）肺部相比，Lkb1野生型肿瘤对免疫细胞群的影响较小（见补充图S2A），而Lkb1突变型肿瘤中则存在多种类型的中性粒细胞和巨噬细胞（见补充图S2A）。对Lkb1突变型肺癌肿瘤微环境中的中性粒细胞进行基因表达分析后发现，其转录程序发生了显著变化，包括Vegfa、Hif1、Havcr2、Tnf、Fcgr2b、Csf1和Ccl3等促肿瘤基因的表达上升（见补充图S2C；参考文献42）。进一步分析发现中性粒细胞存在八种亚群（见图1B；补充图S2D），其中N4和SiglecFHi两种亚群在Lkb1突变型肿瘤中更为丰富（见图1B和C）。尽管SiglecFHi中性粒细胞最近被认定为具有免疫抑制性和促肿瘤作用的髓系细胞，但此前尚未发现其与LKB1突变型肺癌存在关联。此外，这类中性粒细胞寿命较长，不同于循环系统中的中性粒细胞通常寿命较短的特点（见参考文献42）。与较长的寿命相对应，SiglecFHi中性粒细胞和N4中性粒细胞均表现出抗凋亡基因Bcl2a1的更高表达水平（见补充图S2D；参考文献44）。

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Lkb1突变型肿瘤会形成免疫抑制性髓系微环境。A，用于生成具有Lkb1功能缺失突变的自体肺癌肿瘤的基因工程小鼠模型示意图。B，统一流形近似与投影图，展示了Lkb1野生型（sgNeo）和Lkb1突变型（sgLkb1）肺癌模型中的中性粒细胞情况（每种条件下n=2）（见图A）。右侧为中性粒细胞亚群的量化分析结果。C，显示中性粒细胞中SiglecF平均基因表达水平的UMAP图。D，展示图A中肿瘤模型中巨噬细胞情况的UMAP图（每种条件下n=2）。右侧为巨噬细胞亚群的量化分析结果。E，显示巨噬细胞中Arg1平均基因表达水平的UMAP图。F，小鼠肺癌肿瘤中SPP1和ARG1的免疫荧光染色图像，图中标注了比例尺。G，人类肺腺癌中髓系细胞的snRNA-seq分析结果。右侧为KRAS突变肿瘤（n=14）和KRAS/LKB1突变肿瘤（n=4）中髓系细胞群体的量化分析结果。H，利用TCGA的批量RNA测序数据，分析KRAS突变和KRAS/LKB1突变人类肺癌肿瘤中小鼠Arg1+间质巨噬细胞特征的表达情况。I，基于TCGA的数据，对人类LKB1野生型肺腺癌中小鼠Arg1+间质巨噬细胞特征高低水平的患者进行生存分析。J，携带Lkb1突变型肿瘤的小鼠接受了氯龙酸治疗，3周后通过MRI测量肿瘤体积。每个数据点代表一只小鼠，图中显示了平均值及其标准误。统计分析采用了Mann–Whitney U检验和Log-rank检验。*，P<0.05；****，P<0.0001。[A，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/moxmx7v.] 关闭模态框

接下来，我们研究了与Lkb1突变型肿瘤相关的巨噬细胞变化。总体而言，Lkb1突变型肿瘤的巨噬细胞组成发生了显著改变，具体表现为间质巨噬细胞的比例明显高于肺泡巨噬细胞（见图1D；参考文献46）。我们共识别出五种类型的间质巨噬细胞（见图1D；补充图S2E），其中四种亚群——单核型巨噬细胞、CX3CR1+巨噬细胞、Lyve1+巨噬细胞以及Spp1+巨噬细胞——在Lkb1突变型肺癌肿瘤中更为丰富，而间质MФ1亚群的数量则有所减少（见图1D）。此外，我们还发现有一类肺泡巨噬细胞表达了高水平的Spp1，即骨桥蛋白，该蛋白与肺癌不良预后相关（见图1D；参考文献47）。由于巨噬细胞可分为促进或抑制肿瘤生长的两类，因此我们接着分析了数据集中典型的促肿瘤/免疫抑制性巨噬细胞标志物。我们发现Arg1的转录水平存在明显变化，不仅在浸润到Lkb1突变型肿瘤中的巨噬细胞中升高，而且主要存在于间质巨噬细胞中（见图1D和E）。Arg1是免疫抑制性髓系细胞的标志物，这类细胞可通过降解细胞外精氨酸来削弱T细胞的效应功能（参考文献48–53）。为在蛋白质层面验证这些转录变化，我们对肺癌肿瘤进行了ARG1和SPP1的多色免疫荧光染色分析。结果与我们的scRNA-seq分析一致，Lkb1突变型肿瘤中ARG1和SPP1的表达水平均有所上升（见图1F）。为验证单细胞分析所得的髓系细胞变化，我们对KPC模型中携带肿瘤的肺部组织进行了流式细胞术分析（筛选规则见补充图S3A）。通过该分析，我们确认Lkb1突变型肿瘤中含有更高比例的中性粒细胞和间质巨噬细胞，而肺泡巨噬细胞的比例则有所下降（见补充图S4A）。对这类髓系细胞的总数量进行分析时也得到了类似的结果（见补充图S4B）。此外，我们通过流式细胞术进一步证实，免疫抑制性的SiglecFHi中性粒细胞在Lkb1突变型肿瘤中显著富集（见补充图S4C）。为探究这些免疫细胞浸润的变化是与肿瘤遗传学特征相关，还是由肿瘤负荷所致，我们在肿瘤形成后6周和11周分别进行了流式细胞术免疫分析（见补充图S4D和S4E）。在6周时，Lkb1突变型肿瘤与Lkb1野生型肿瘤的肿瘤负荷之间没有显著差异（补充图S4D）。尽管肿瘤负荷无差异，但我们发现中性粒细胞和间质巨噬细胞的数量显著增加，而肺泡巨噬细胞的数量则显著减少（补充图S4E），这表明肿瘤中Lkb1的缺失而非肿瘤负荷才是导致髓系细胞浸润异常的驱动因素。这些差异在11周时更为明显（补充图S4D和S4E）。接下来，我们通过测定PMA/离子霉素诱导的细胞因子IFNγ和TNFα的产生量来评估T细胞功能（补充图S3A）。我们发现，在实验开始11周后从Lkb1突变型肺癌肿瘤中采集的CD4和CD8 T细胞，其IFNγ和TNFα的表达显著降低（补充图S4F），这说明这种基因亚型的肺癌中效应T细胞功能严重受损。随后，我们想了解在我们的GEMM模型中发现的这些免疫抑制性髓系细胞是否也存在于人类LUAD中。为了了解人类LKB1突变型肿瘤中的髓系细胞浸润情况，我们对KRAS突变型与KRAS-LKB1共突变型肺癌肿瘤进行了单核RNA测序（snRNA-seq）分析（图1G）。通过这项分析，我们识别出了9种髓系细胞亚群（46），其中5种为间质巨噬细胞（CX3CR1+ MФ、SPP1+ MФ2、mo-MФ1、mo-MФ2以及C1QB + MФ；图1G；补充图S5A）。与我们小鼠模型中的数据一致（图1D），LKB1突变型肺癌肿瘤中间质巨噬细胞亚群更为丰富（图1G）。由于在单细胞数据集中难以检测到中性粒细胞的转录本，我们通过观察人类肿瘤组织切片来评估肿瘤突变状态对中性粒细胞数量的影响。我们使用了包含LKB1野生型和突变型LUAD样本的基因定义肿瘤微阵列（TMA），并用中性粒细胞标志物髓过氧化物酶（MPO）进行染色。与我们小鼠模型中的结果一致（图1B；补充图S4A、S4B和S4E），我们发现人类LKB1突变型肿瘤中的中性粒细胞浸润程度远高于野生型对照肿瘤（补充图S5B）。为了进一步研究免疫抑制性巨噬细胞群体对LUAD患者的影响，我们利用小鼠scRNA-seq数据集构建了Arg1+间质巨噬细胞特征标志物（图1D和E；补充图S5C），并使用癌症基因组图谱（TCGA）的批量RNA测序数据集来检测该标志物在人类肺癌肿瘤中的富集情况。在比较KRAS突变型与KRAS-LKB1共突变型LUAD时，我们发现Arg1+间质巨噬细胞特征标志物在LKB1功能丧失突变的人类肿瘤中显著富集（图1H）。接着，我们利用TCGA数据集进一步研究该特征标志物是否会对LKB1野生型LUAD患者的预后产生影响。根据该标志物的高低表达对患者进行分类后，我们发现Arg1+间质巨噬细胞特征标志物与更差的生存率相关（图1I），这进一步证明了这类巨噬细胞具有促肿瘤生成作用。基于上述数据，我们推测渗透到Lkb1突变型肺癌肿瘤中的Arg1+间质巨噬细胞会损害T细胞功能，而通过清除这些细胞，我们可以抑制肿瘤生长。根据给药途径的不同，氯龙酸可用于减少包括间质巨噬细胞在内的单核细胞衍生细胞群，且不会显著影响肺泡巨噬细胞（54）。在我们的Lkb1突变型肺癌GEMM模型中，我们通过眶后注射氯龙酸3周来减少间质巨噬细胞的浸润（补充图S6A），结果发现这种处理不仅提升了效应T细胞的功能（补充图S6B），还显著降低了肿瘤负荷（图1J），从而从功能上证明了间质巨噬细胞具有免疫抑制作用并能促进肿瘤发生。总体而言，我们发现Lkb1突变型肿瘤通过重塑肿瘤微环境中的特定巨噬细胞和中性粒细胞亚群，形成了一个免疫抑制性微环境。Lkb1突变型肿瘤中的自分泌LIF信号通路可增强肿瘤发生。

鉴于髓系细胞浸润和转录程序的显著变化，我们推测Lkb1突变型肿瘤具有独特的炎症性转录特征，从而导致SiglecFHi阳性中性粒细胞和Arg1+间质巨噬细胞的富集。为确定这种肿瘤微环境变化的驱动因素，我们根据GFP肿瘤报告基因对KPC GEMM模型中的肿瘤细胞进行分选（GFP+，CD45?；图1A），然后进行批量RNA测序。与Lkb1野生型肺癌肿瘤相比，Lkb1突变型肿瘤中富集的基因集包括上皮-间质转化（EMT）、缺氧反应以及炎症反应相关的标志性基因集（补充图S7A）。我们重点分析了因突变而发生变化的细胞因子，发现Il6、Il33和Csf3在Lkb1突变型肿瘤细胞中的表达升高（图2A）。此外，与Lkb1功能丧失突变相关的多种趋化因子也在肿瘤细胞中表达上升，包括Ccl2、Ccl7、Cxcl1、Cxcl5和Cxcl7，这一结果与先前的研究一致（图2A；参考文献30、55–59）。图2. 查看大图下载幻灯片 自分泌LIF信号通路可增强肺癌肿瘤发生。A，通过对分离得到的小鼠Lkb1野生型及突变型肿瘤进行RNA测序分析，检测部分细胞因子的基因表达情况。每列代表一只小鼠。B，检测携带肿瘤的小鼠支气管肺泡液中的LIF含量。每个点代表一只小鼠。C，根据LKB1突变状态对TCGA LUAD患者进行的LIF表达的实证累积分布函数图。D，比较TCGA LUAD队列中患者的Kaplan–Meier 5年生存曲线。E和F，(E)小鼠和(F)人类LUAD肿瘤内的pSTAT3染色情况。对于(E)中的数据，每个点代表一个肿瘤样本。G，展示通过删除Lif或Lifr来生成自发性的Lkb1突变型肺癌肿瘤的示意图。右侧显示了通过MRI测量的肿瘤负荷及代表性图像。每个点代表一只小鼠。H，展示删除Lif或Lifr后的小鼠Lkb1突变型肺癌肿瘤内的pSTAT3染色情况。每个点代表一个肿瘤样本。图中显示了平均值和标准误。统计分析采用Mann–Whitney U检验或单因素方差分析结合Tukey多重比较检验。*，P < 0.05；**，P < 0.01；****，P < 0.0001。[G，由BioRender生成。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/0rg9p8l.] 图2. 查看大图下载幻灯片 自分泌LIF信号通路可增强肺癌肿瘤发生。A，通过对分离得到的小鼠Lkb1野生型及突变型肿瘤进行RNA测序分析，检测部分细胞因子的基因表达情况。每列代表一只小鼠。B，检测携带肿瘤的小鼠支气管肺泡液中的LIF含量。每个点代表一只小鼠。C，根据LKB1突变状态对TCGA LUAD患者进行的LIF表达的实证累积分布函数图。D，比较TCGA LUAD队列中患者的Kaplan–Meier 5年生存曲线。E和F，(E)小鼠和(F)人类LUAD肿瘤内的pSTAT3染色情况。对于(E)中的数据，每个点代表一个肿瘤样本。G，展示通过删除Lif或Lifr来生成自发性的Lkb1突变型肺癌肿瘤的示意图。右侧显示了通过MRI测量的肿瘤负荷及代表性图像。每个点代表一只小鼠。H，展示删除Lif或Lifr后的小鼠Lkb1突变型肺癌肿瘤内的pSTAT3染色情况。每个点代表一个肿瘤样本。图中显示了平均值和标准误。统计分析采用Mann–Whitney U检验或单因素方差分析结合Tukey多重比较检验。*，P < 0.05；**，P < 0.01；****，P < 0.0001。[G，由BioRender生成。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/0rg9p8l.] 关闭模态框

在Lkb1突变型肺癌肿瘤中表达升高的一个显著基因是细胞因子Lif（图2A）。LIF对于干细胞的维持至关重要，在胚胎发育和细胞分化过程中具有多种生理功能（60–63）。此前已有研究探讨过LIF的直接免疫抑制作用（37），但LIF信号通路对肿瘤细胞本身的影响，以及该信号通路如何促进免疫抑制性肿瘤微环境的形成，目前尚未得到充分研究。为补充我们的RNA测序数据，我们在固定的肺癌肿瘤上进行了RNA原位杂交分析，结果发现只有Lkb1突变型肿瘤中存在Lif转录本（补充图S7B）。为验证LIF的分泌蛋白水平与我们的基因表达数据一致，我们对支气管肺泡灌洗液进行了多重细胞因子分析，结果发现来自Lkb1突变型肿瘤小鼠的样本中LIF水平升高，同时其他细胞因子如IL6、CCL2和CSF3也有所升高（补充图S7C）。为确保这种上调现象在人类LUAD中也存在，我们分析了TCGA数据库中的RNA测序数据，结果发现LKB1突变型肿瘤患者体内的LIF确实表达升高（图2C）。此外，肿瘤中LIF表达水平较高的肺癌患者的生存率明显低于表达水平较低的患者（图2D）。先前的研究已经确定，LKB1下游的肿瘤抑制因子为盐诱导激酶（SIK；参考文献28、29、64–66），而LKB1或SIKs的缺失会导致肿瘤发生率上升以及炎症性转录程序的激活。我们推测，在我们的模型中，同样是这条炎症信号通路调控了Lif的表达。为探究这一通路，我们利用小鼠KP LUAD细胞系，通过CRISPR/Cas9编辑技术生成了Lkb1敲除细胞株。与体内实验结果一致，体外条件下Lkb1的缺失也导致了Lif表达升高（补充图S7D）。在Lkb1已被删除的KP细胞系中，若再敲除SIK的下游磷酸化靶标Crtc2，Lif的表达则会下降，其程度与对照组细胞系（sgNeo/sgTom）相似（补充图S7D）。已有研究表明，SIK家族的多个成员（SIK1、SIK2和SIK3）能够调控CRTC2的活性（28、29）。为测试SIK家族是否在Lkb1调控Lif的过程中起中介作用，我们用泛SIK抑制剂YKL-06-061处理小鼠（KP）或人类（H2009）的LKB1野生型LUAD细胞系。该抑制剂处理后导致Lif表达显著升高（补充图S7E）。最后，为研究LKB1对Lif的调控作用是否在其他实体瘤类型中也存在，例如在可能发生LKB1突变的胰腺癌中，我们在HY19636胰腺导管腺癌细胞中敲除了Lkb1。与肺癌细胞系的结果一致，Lkb1的缺失也导致了Lif表达升高（补充图S7F），这表明LKB1/SIK/CRTC2通路对Lif的调控作用并非仅限于肺癌。LIF通过LIF受体（LIFR）传递信号，这一信号传导过程通常由STAT3介导（38、60），因此Lkb1突变型肿瘤中活跃的LIF信号传导应会导致磷酸化STAT3（pSTAT3）水平上升，而pSTAT3正是STAT3的活性形式（70）。与这一推测相符，我们对源自GEMM模型的肺癌肿瘤进行的免疫组化分析显示，Lkb1突变型肿瘤中的pSTAT3水平显著升高（图2E），这说明肿瘤细胞中存在活跃的LIF信号传导。利用我们构建的基因定义人类肿瘤微阵列，我们也得到了类似的结果：LKB1突变型肿瘤中的pSTAT3水平显著高于野生型肿瘤（图2F；补充图S7G）。这一pSTAT3上调的现象使我们推测，Lkb1突变型肿瘤利用一种癌细胞特异性的LIF-LIFR自分泌信号通路来重塑肿瘤微环境并促进肿瘤生长。为研究癌细胞中是否存在这种自分泌LIF信号循环，我们设计了一种双引导序列慢病毒（71），用于在Lkb1突变型肿瘤细胞中特异性删除Lif或LIFR（图2G，LIFR sgRNA的验证结果见补充图S8A）。在Lkb1突变型肿瘤中删除Lif后，与对照组（sgNeo）相比，肿瘤负荷显著降低（图2G；补充图S8B）。重要的是，在Lkb1突变型肺癌肿瘤中删除LIFR也会导致肿瘤负荷显著下降（图2G；补充图S8B），这表明Lkb1突变型肿瘤中的LIF信号传导确实处于活跃状态，并且是通过癌细胞内的自分泌信号循环来推动肿瘤发生的，而非直接作用于周围微环境中的免疫细胞。LIF信号传导的阻断还会导致STAT3活化程度下降，这在缺乏Lif或LIFR的Lkb1突变型肿瘤中表现为pSTAT3水平降低（图2H）。与Lkb1突变型野生型肿瘤中Lif表达水平较低的事实一致（图2A和B），在Lkb1野生型KP肿瘤中删除Lif并未对肿瘤负荷产生任何影响（补充图S8C）。在分析支气管肺泡灌洗液中的炎症标志物时，我们发现当Lkb1突变型肿瘤中的Lif被删除后，其浓度接近背景水平，这表明大部分LIF来自肿瘤本身（补充图S8D）。此外，删除Lif或LIFR后，支气管肺泡灌洗液中的其他炎症介质，如IL6（补充图S8D）、CSF3和CCL2（补充图S8E）的水平也有所下降，这进一步证明了肿瘤特异性的LIF信号传导是这些细胞因子调控的主要因素。在人类肺腺癌中，LKB1突变常与Kras突变同时出现，但LKB1、KRAS和TP53三重突变则较为罕见（72）。为利用Trp53野生型肿瘤模型验证LKB1–LIF信号轴在免疫调节中的作用，我们采用了KrasLSL-G12D/+Lkb1fl/fl（KL）GEMM模型（30），在Trp53野生型（Trp53+/+）肿瘤背景下生成有或无Lifr缺失的Lkb1突变肿瘤。在此模型中，Lkb1突变肺癌肿瘤中删除Lifr可降低肿瘤负荷（补充图S8F）及pSTAT3表达水平（补充图S8G），这一结果与Trp53突变肿瘤的情况一致（图2G和H）。在另一个Trp53野生型模型（KrasLSL-G12D/+ Rosa26LSL-Cas9-P2A-GFP/LSL-Cas9-P2A-GFP，简称KC）中，我们同样发现删除Lkb1突变肺癌肿瘤中的Lifr可降低肿瘤负荷（补充图S8H）并延长小鼠存活时间（补充图S8I）。综合这些结果以及我们在Trp53野生型Lkb1背景下的研究结果（补充图S8C），可以推断无论Trp53突变状态如何，Lkb1突变肿瘤都需要自分泌的LIF信号传导。为证明在Lkb1突变肿瘤细胞中缺失Lif或Lifr不会影响细胞的增殖能力，我们体外检测了缺失Lif和Lifr的Lkb1突变小鼠KP细胞系的生长情况。与对照组细胞（sgTom）相比，删除Lif或Lifr并未影响这些细胞的增殖能力（补充图S8J），进一步表明肿瘤中的LIF信号传导是通过调节免疫反应等细胞外机制来促进肿瘤发生的。目前的研究结果表明，LKB1/SIK/CRTC2信号轴可转录调控细胞因子LIF，而Lkb1突变肿瘤会通过自分泌LIF信号传导来促进炎症反应和肿瘤发生。肿瘤LIF信号传导会重塑肿瘤微环境，从而抑制抗肿瘤T细胞反应。

由于肿瘤LIF信号传导缺失会导致肿瘤负荷和炎症介质发生显著变化，我们接下来探讨自分泌LIF信号传导是否与Lkb1突变肺癌肿瘤中异常的免疫浸润有关。为此，我们使用了单细胞分析技术——通过测序实现转录组与表位的分级分析（ExCITE-seq；参考文献73–75），该技术能够在单细胞水平上同时分析基因表达、表面蛋白表达以及T细胞受体序列，用于检测含有Lif或Lifr缺失的Lkb1突变肺癌肿瘤中的免疫细胞和肿瘤细胞（图2G；补充图S9A）。从整体免疫细胞群来看，无论是通过删除Lif还是Lifr来破坏肿瘤LIF信号传导，都会导致中性粒细胞数量减少，而巨噬细胞和T细胞数量增加（补充图S9A）。为确保免疫细胞中未发生慢病毒感染和基因编辑，我们检测了GFP和Cas9的表达情况，这两种蛋白在慢病毒感染后会条件性表达（图1A）。这两类标记物仅在肿瘤细胞中表达，在免疫细胞中则不存在（补充图S9B）。通过ExCITE-seq分析，我们发现LIF信号传导被阻断后，特定类型的巨噬细胞亚群会出现显著增减（图3A和B；补充图S10A和S10B）。通过蛋白质表达分析，我们能够明确区分肺泡巨噬细胞（CD11c+/CD169+）和间质巨噬细胞（CD11b+/CD14+；补充图S10B）。在肿瘤中删除Lif和Lifr后，一种以高Arg1表达为特征的间质巨噬细胞群体（Arg1Hi MФ）数量显著减少（图3A和B；补充图S10A和S10B）。此外，我们发现肿瘤LIF信号传导被阻断后，整体Arg1表达水平下降，而这种表达主要存在于CD11b+间质巨噬细胞中，而非CD11c+/CD169+肺泡巨噬细胞中（图3B；补充图S10B），这一现象在Trp53野生型肿瘤中也存在（补充图S10C）。与这些变化相伴的是，我们检测到ISGHi MФ群体数量增加（图3A；补充图S10A；参考文献37），这类巨噬细胞以Cxcl9和Isg15蛋白的表达为特征，而这两种蛋白与更强的抗肿瘤反应相关（76）。接下来，我们分析了ExCITE-seq数据集中的中性粒细胞亚群，再次识别出了八种不同的中性粒细胞亚群（图3C；补充图S10D）。对这类中性粒细胞的定量分析显示，所有亚群的数量均有所减少，其中包括具有免疫抑制作用的SiglecFHi亚群（图3C；补充图S10D），在KL（Trp53野生型）肿瘤中删除Lifr后也观察到了类似的变化（补充图S10E）。总体而言，破坏自分泌LIF信号传导可以逆转Lkb1突变肺癌肿瘤所引发的免疫抑制性髓系细胞浸润。由于在肿瘤细胞中删除Lif或Lifr都会导致髓系细胞出现类似变化，我们得出结论：正是肿瘤内的自分泌LIF信号传导，而非LIF对免疫细胞的直接作用，导致了Lkb1突变肿瘤引发的免疫抑制性髓系细胞变化。图3. 查看大图 下载幻灯片 LIF信号传导会增强免疫抑制性髓系细胞浸润并抑制T细胞反应。我们从携带Lkb1突变肿瘤且分别缺失Lif或Lifr的小鼠体内分离出免疫细胞，随后进行ExCITE-seq分析（每种处理条件下每组2只小鼠）。A图为巨噬细胞亚群的均匀流形近似与投影（UMAP）图，右侧为各亚群的数量统计。B图为表达Arg1蛋白的巨噬细胞的UMAP图。C图为中性粒细胞亚群的UMAP图，右侧为相应数量统计。D图为通过ExCITE-seq分析得到的T细胞/NK细胞/固有淋巴细胞亚群分布图。E图为来自Lkb1突变肿瘤肺组织的T细胞的克隆型分析图，每个彩色点代表一个扩增的TCR克隆（阈值≥5个克隆），深灰色点表示未检测到TCR，浅灰色点表示未扩增的TCR克隆。F图为给携带Lkb1（sgLkb1/sgNeo）或Lkb1/Lifr（sgLkb1/sgLifr）基因敲除肿瘤的小鼠注射抗CD4抗体和抗CD8抗体后的实验情况，8周治疗后通过MRI检测肿瘤负荷，每个点代表一只小鼠，图中显示了平均值和标准误，统计分析采用Mann–Whitney U检验，ns表示无显著性差异，**表示P<0.01，ILC指固有淋巴细胞。[F图由BioRender制作，Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/722lykv.] 图3. 查看大图 下载幻灯片 LIF信号传导会增强免疫抑制性髓系细胞浸润并抑制T细胞反应。我们从携带Lkb1突变肿瘤且分别缺失Lif或Lifr的小鼠体内分离出免疫细胞，随后进行ExCITE-seq分析（每种处理条件下每组2只小鼠）。A图为巨噬细胞亚群的均匀流形近似与投影（UMAP）图，右侧为各亚群的数量统计。B图为表达Arg1蛋白的巨噬细胞的UMAP图。C图为中性粒细胞亚群的UMAP图，右侧为相应数量统计。D图为通过ExCITE-seq分析得到的T细胞/NK细胞/固有淋巴细胞亚群分布图。E图为来自Lkb1突变肿瘤肺组织的T细胞的克隆型分析图，每个彩色点代表一个扩增的TCR克隆（阈值≥5个克隆），深灰色点表示未检测到TCR，浅灰色点表示未扩增的TCR克隆。F图为给携带Lkb1（sgLkb1/sgNeo）或Lkb1/Lifr（sgLkb1/sgLifr）基因敲除肿瘤的小鼠注射抗CD4抗体和抗CD8抗体后的实验情况，8周治疗后通过MRI检测肿瘤负荷，每个点代表一只小鼠，图中显示了平均值和标准误，统计分析采用Mann–Whitney U检验，ns表示无显著性差异，**表示P<0.01，ILC指固有淋巴细胞。[F图由BioRender制作，Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/722lykv.] 关闭模态框

通过在Lkb1突变肿瘤中通过基因敲除Lif或Lifr降低免疫抑制性髓系细胞浸润的程度后，我们接下来研究了破坏肿瘤LIF信号传导对T细胞反应的影响。我们对淋巴细胞群（T细胞、固有淋巴细胞和NK细胞）进行了亚群分类，并通过基因和蛋白质表达指标（Sell、Ccr7、Lef1、Nkg7、KLRG1和PD-1）来识别处于初始状态和效应状态的CD4和CD8 T细胞亚群（图3D；补充图S11A–S11D；参考文献77–83）。无论是删除Lif还是Lifr，都会导致调节性T细胞数量减少，而CD4和CD8 T细胞效应细胞群则没有明显变化（图3D；补充图S11A）。由于CD4和CD8 T细胞效应细胞群未出现显著变化，我们利用ExCITE-seq数据集来探究LIF信号传导是否会影响抗原特异性T细胞的克隆扩增情况。在检测Lkb1突变肺癌肿瘤时，未观察到T细胞的克隆扩增现象（图3E），这与肿瘤微环境的免疫抑制特性相符。有趣的是，当我们同时删除Lif和Lifr后，却在CD4和CD8 T细胞中观察到了T细胞克隆型的扩增现象（图3E），这表明抗原驱动的免疫反应有所增强。为评估从Lkb1突变肿瘤中分离出的T细胞的功能，我们检测了其细胞因子表达情况，发现破坏LIF信号传导会导致CD4和CD8 T细胞产生的TNFα和IFNγ水平上升（补充图S11E）。在p53野生型肿瘤中 também观察到了删除Lifr后T细胞细胞因子产生增加的现象（补充图S11F和S11G）。为确定LIF是否会对T细胞功能产生直接影响，我们在体外将重组LIF添加到活化的小鼠CD4和CD8 T细胞中。结果显示，向T细胞中添加重组LIF并未影响TNFα和IFNγ的表达水平（补充图S11H），这进一步支持了在该肿瘤模型中LIF不对T细胞产生直接作用的观点。为验证自分泌LIF信号传导确实会抑制抗肿瘤T细胞的免疫监视功能，我们建立了有或无Lifr缺失的Lkb1突变肿瘤模型，肿瘤形成3周后，使用特异性抗体清除小鼠体内的CD4和CD8 T细胞（图3F）。8周的T细胞清除操作显著增加了肿瘤负荷，这说明在含有Lifr缺失的Lkb1突变肿瘤中，T细胞通过抗原特异性或非特异性T细胞介导的杀伤机制在主动抑制肿瘤生长（图3F）。与LIF信号传导完整的Lkb1突变肿瘤的免疫抑制特性一致，T细胞清除并未对这类肿瘤的生长产生影响（图3F）。因此，我们可以得出结论：在Lkb1突变肿瘤中破坏自分泌LIF信号传导可以解除对抗肿瘤T细胞反应的抑制。综上所述，我们证实Lkb1突变肿瘤会上调细胞因子LIF的水平，该因子通过与自身的受体LIFR形成仅在癌细胞内存在的自分泌信号循环，进而导致免疫抑制性髓系细胞在肿瘤中大量聚集，并抑制抗肿瘤T细胞的反应。自分泌LIF信号传导会诱导Sox17阳性的炎性肿瘤细胞状态。

鉴于LIF信号传导是通过一种仅在癌细胞内发挥作用的机制来在肿瘤微环境中引发免疫抑制作用（图3A–F），我们接下来研究了自分泌LIF信号传导在肿瘤细胞本身的作用。首先，我们利用ExCITE-seq数据集分析了有或无Lif或Lifr缺失的Lkb1突变肿瘤细胞，重点关注那些可能参与髓系细胞招募和功能的细胞因子。在LIF信号传导被阻断的肿瘤中，包括Csf3、Il33、Cxcl2和Cxcl5等多种细胞因子表达水平均有所下降（补充图S12A），这表明LIF会改变肿瘤细胞内的炎症相关基因表达程序。为了解析自分泌LIF信号传导在Lkb1突变肿瘤中带来的肿瘤可塑性变化，我们对肿瘤细胞进行了亚群分类，共识别出八种独特的肿瘤细胞状态（图4A；补充图S12B），这些状态与先前发表的研究结果一致（13）。在检测缺失Lif或Lifr的肿瘤时，我们发现有两种细胞状态的数量显著减少（第5组和第8组；图4A）。有趣的是，这两种与LIF相关的特殊细胞状态与其他肿瘤细胞状态的不同之处在于，它们表现出更高的EMT相关基因表达水平（补充图S12C），同时不表达Nkx2-1基因（补充图S12D），这反映出它们处于去分化状态（84, 85）。此外，第5组和第8组细胞状态之间还存在一个显著差异，即它们都表达Sox17基因（图4B）。Sox17是一种转录因子，已被证实与结直肠肿瘤的发生（86）以及Lkb1突变肿瘤的转移过程（65）有关，但目前尚不清楚Sox17在原发性Lkb1突变肺癌肿瘤中的作用，以及它与LIF之间存在何种关联。我们通过免疫组化方法确认，Sox17确实在部分Lkb1突变肺癌肿瘤中表达，而且当删除Lif或Lifr后，表达Sox17的肿瘤数量会减少（图4C）。接下来，我们检测了p53野生型肿瘤中的Sox17表达情况，发现其在保持自分泌LIF信号传导正常的Lkb1突变（sgLkb1_sgNeo）肿瘤中的表达水平最高（补充图S12E），这一结果与我们之前建立的p53突变模型中的观察结果一致（图4C）。此外，Sox17的表达仅出现在Lkb1突变肺癌肿瘤中，并非Keap1突变肺癌等恶性程度更高的肿瘤所共有的特征（图4D；参考文献41, 87, 88）。为进一步证实Sox17的表达仅存在于Lkb1突变型肺癌肿瘤中，我们分析了此前基于Lkb1突变型肺癌小鼠模型发布的两个RNA-seq数据集（30, 89）。在这些数据集中，我们观察到在Lkb1缺失的肿瘤中Sox17和Lif的表达均上升，而当恢复WT型Lkb1后，这两种基因的表达则下降（补充图S12F）。图4. 查看大图 下载幻灯片 自分泌LIF信号可促进肿瘤可塑性，并诱导炎症性的Sox17+肿瘤细胞状态。A，对Lif或Lifr被删除的小鼠Lkb1突变型肿瘤亚群进行的ExCITE-seq分析（每种条件下n=2）。右侧显示了各亚群的量化结果。B，展示了平均Sox17基因表达水平的肿瘤细胞的均匀流形近似与投影图。C，通过IHC检测Lif或Lifr被删除的小鼠Lkb1突变型肺癌肿瘤中的SOX17表达情况。右侧显示了具有阳性SOX17染色的肿瘤比例以及SOX17的表达程度。D，通过IHC检测Keap1、Lkb1被删除的KP肺癌肿瘤以及对照组（sgNeo）中的SOX17表达情况。右侧显示了具有阳性SOX17染色的肿瘤比例以及SOX17的表达程度。E，按肿瘤亚群（左侧）和肿瘤遗传特征（右侧）划分的高水平与低水平Hallmark炎症反应特征的表达情况。F，基于TCGA RNA-seq LUAD数据集，分析KRAS及KRAS/LKB1突变型人类肿瘤中小鼠Sox17肿瘤特征的富集情况。图中展示了个体患者的情况。G，利用TCGA数据，根据小鼠Sox17特征的高低对LUAD患者进行分层，分析其生存情况。采用对数秩检验进行分析。*，P<0.05；****，P<0.0001。图4. 查看大图 下载幻灯片 自分泌LIF信号可促进肿瘤可塑性，并诱导炎症性的Sox17+肿瘤细胞状态。A，对Lif或Lifr被删除的小鼠Lkb1突变型肿瘤亚群进行的ExCITE-seq分析（每种条件下n=2）。右侧显示了各亚群的量化结果。B，展示了平均Sox17基因表达水平的肿瘤细胞的均匀流形近似与投影图。C，通过IHC检测Lif或Lifr被删除的小鼠Lkb1突变型肺癌肿瘤中的SOX17表达情况。右侧显示了具有阳性SOX17染色的肿瘤比例以及SOX17的表达程度。D，通过IHC检测Keap1、Lkb1被删除的KP肺癌肿瘤以及对照组（sgNeo）中的SOX17表达情况。右侧显示了具有阳性SOX17染色的肿瘤比例以及SOX17的表达程度。E，按肿瘤亚群（左侧）和肿瘤遗传特征（右侧）划分的高水平与低水平Hallmark炎症反应特征的表达情况。F，基于TCGA RNA-seq LUAD数据集，分析KRAS及KRAS/LKB1突变型人类肿瘤中小鼠Sox17肿瘤特征的富集情况。图中展示了个体患者的情况。G，利用TCGA数据，根据小鼠Sox17特征的高低对LUAD患者进行分层，分析其生存情况。采用对数秩检验进行分析。*，P<0.05；****，P<0.0001。关闭模态框

由于中断自分泌LIF信号能够逆转免疫抑制性髓系表型，我们推测这些依赖LIF的独特肿瘤细胞状态会高表达炎症基因，从而促进免疫抑制性髓系细胞的聚集。针对Hallmark炎症反应途径的分析表明，这一特征主要存在于两个类似EMT的肿瘤亚群（第5组和第8组），而删除Lif或Lifr后该途径的表达会降低（图4E）。LIF在体外常被用于维持干细胞，因此我们检测了这种Sox17+状态是否表达任何干细胞标记物。与Sox17+肿瘤细胞状态共表达的一个特别显著的干细胞标记物是CD133（由Prom1编码；补充图S12G；参考文献90），它与TTF1的蛋白表达水平呈负相关（补充图S12H）。基于上述数据，再加上SOX17是一种已知参与细胞状态及胚胎发育的转录因子（91），我们推测LIF信号正在诱导一种去分化程序（补充图S12D），使肿瘤向Sox17+干细胞状态（补充图S12G）及类似EMT的状态（补充图S12C）转变。对这些肿瘤细胞状态的伪时间分析（92–94）也支持了Sox17+细胞状态很可能由分化程度更高的肿瘤细胞状态发展而来这一观点（补充图S12I）。为验证LIF依赖的肿瘤细胞状态是否存在于人类LKB1突变型肿瘤中，我们通过比较Sox17+细胞状态与其他剩余肿瘤状态下的基因表达，构建了一个基因特征谱（补充图S12J）。随后，我们在TCGA数据库中的LUAD肿瘤RNA-seq数据中检测了这一Sox17+肿瘤特征谱的表达情况。值得注意的是，与LKB1野生型肿瘤相比，人类LKB1突变型肺癌肿瘤中我们的小鼠Sox17+特征谱显著富集（图4F）。此外，这一特征谱与总体生存期的显著缩短相关（图4G）。基于与Sox17+细胞状态相关的炎症基因程序，我们推测删除Sox17将消除炎症特征，并逆转Lkb1突变型肿瘤的免疫抑制特性。为证明Sox17的功能作用，我们在GEMM模型中建立了有/无Sox17删除的Lkb1突变型小鼠肿瘤（图5A）。11周后，我们发现Sox17的删除显著降低了Lkb1突变型肿瘤的负荷（图5A），这首次证明了该转录因子对原发性肺癌肿瘤的生长至关重要。为评估这些肿瘤的炎症表型，我们检测了携带肿瘤小鼠支气管肺泡液中的细胞因子水平。删除Sox17后LIF水平并无显著变化（图5B），这与Sox17处于LIF信号传导路径的下游一致。然而，在Sox17缺乏的肿瘤细胞中，包括IL6、CSF3和CCL2在内的多种细胞因子水平显著下降（图5B），这证实了Sox17在Lkb1突变型肿瘤的LIF介导的炎症程序中起着关键作用。最后，当我们检测Sox17删除后的T细胞功能时，发现CD4和CD8 T细胞产生的IFNγ和TNFα水平显著升高（图5C），这说明Lkb1突变型肿瘤的免疫抑制性微环境得到了逆转，这一结果与删除LIF信号时的观察结果相似（补充图S11E–S11G）。总体而言，我们证明了Lkb1突变型肺癌肿瘤内的自分泌LIF信号会诱导肿瘤去分化与炎症反应，而这些过程都依赖于转录因子SOX17。删除Sox17可减轻炎症反应，并增强效应T细胞的功能。图5. 查看大图 下载幻灯片 Sox17在Lkb1突变型肿瘤中驱动炎症反应，从而促进肿瘤的免疫逃逸。A，展示通过删除Sox17来生成体内源性Lkb1突变型肺癌肿瘤的示意图。右侧通过MRI显示了肿瘤负荷情况。图中展示了单个小鼠。B，检测A组小鼠支气管肺泡液中的LIF、IL6、CSF3和CCL2水平。图中展示了单个小鼠。C，检测从A组携带肿瘤的肺部分离出的、经PMA/离子霉素刺激的CD4和CD8 T细胞中的TNFα和IFNγ水平。图中展示了单个小鼠。统计分析采用Mann–Whitney U检验法，显示了平均值和标准误。ns表示无显著性差异；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。[A，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/3sauz58.] 图5. 查看大图 下载幻灯片 Sox17在Lkb1突变型肿瘤中驱动炎症反应，从而促进肿瘤的免疫逃逸。A，展示通过删除Sox17来生成体内源性Lkb1突变型肺癌肿瘤的示意图。右侧通过MRI显示了肿瘤负荷情况。图中展示了单个小鼠。B，检测A组小鼠支气管肺泡液中的LIF、IL6、CSF3和CCL2水平。图中展示了单个小鼠。C，检测从A组携带肿瘤的肺部分离出的、经PMA/离子霉素刺激的CD4和CD8 T细胞中的TNFα和IFNγ水平。图中展示了单个小鼠。统计分析采用Mann–Whitney U检验法，显示了平均值和标准误。ns表示无显著性差异；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。[A，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/3sauz58.] 关闭模态框

LIF中和可靶向Sox17+肿瘤细胞状态，从而恢复抗肿瘤免疫力

由于在肿瘤形成初期就基因删除LIF信号或Sox17能够有效逆转肿瘤炎症反应和免疫逃逸，接下来我们评估了在已形成的Lkb1突变型肿瘤中抑制自分泌LIF信号的治疗潜力。肿瘤形成8周后，我们给小鼠注射了LIF中和抗体（37）持续3周，随后对肿瘤微环境进行了全面分析（图6A）。与删除Lif或Lifr的结果类似（图2G），LIF中和也成功抑制了Lkb1突变型肺癌肿瘤的生长（图6A；补充图S13A），这表明抗LIF抗体对于那些LIF表达水平较高的肺癌肿瘤而言是一种有效的疗法。为评估LIF中和对肿瘤可塑性的影响，我们在注射抗LIF抗体后对分离得到的肺癌肿瘤进行了CITE-seq分析（图6A；补充图S13B）。通过无偏聚类分析，我们识别出了8种肿瘤细胞状态，其中一些表现出类似EMT的特征，其中有2种表达了Sox17（图6B和C；补充图S13C和S13D）。LIF中和显著减少了两种Sox17+状态的存在（图6B和C），这表明持续的LIF信号对于维持Sox17+肿瘤细胞状态至关重要。这些依赖LIF的细胞状态还表达了多种干细胞标记物，包括Prom1、Hmga2和K（补充图S13E；参考文献90、95–97）。图6. 查看大图 下载幻灯片 LIF中和可消除Sox17+肿瘤细胞状态，从而恢复抗肿瘤免疫力。A，展示用抗LIF抗体治疗体内源性Lkb1突变型肺癌肿瘤的示意图。右侧通过MRI显示了肿瘤负荷情况。B，展示LIF中和后Lkb1突变型肿瘤亚群的CITE-seq分析结果，右侧为量化数据（每种条件下n=2）。C，展示有无LIF中和情况下Lkb1突变型肺癌肿瘤中Sox17基因表达的均匀流形近似与投影图。D，检测A组小鼠支气管肺泡液中的IL6、CSF3和CCL2水平。E和F，通过流式细胞术检测A组携带肿瘤的小鼠肺部中SiglecFHi阳性中性粒细胞以及Arg1+阳性间质巨噬细胞的数量。G，携带Lkb1突变型肿瘤的小鼠分别接受了抗LIF抗体、抗CD4抗体和抗CD8抗体治疗，或同时接受这三种抗体治疗，或是接受同种型对照抗体治疗。治疗3周后，通过MRI检测了肿瘤负荷情况。H，展示LIF如何在Lkb1突变型肿瘤中诱导Sox17+细胞状态，进而招募免疫抑制性髓系细胞并削弱抗肿瘤T细胞反应的示意图。对于柱状图，每个点代表一只小鼠。显示了平均值和标准误。统计分析采用Mann–Whitney U检验法或单因素方差分析结合Tukey多重比较检验。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。[A，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/wn7dqit；H，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/bxa4svd.] 图6. 查看大图 下载幻灯片 LIF中和可消除Sox17+肿瘤细胞状态，从而恢复抗肿瘤免疫力。A，展示用抗LIF抗体治疗体内源性Lkb1突变型肺癌肿瘤的示意图。右侧通过MRI显示了肿瘤负荷情况。B，展示LIF中和后Lkb1突变型肿瘤亚群的CITE-seq分析结果，右侧为量化数据（每种条件下n=2）。C，展示有无LIF中和情况下Lkb1突变型肺癌肿瘤中Sox17基因表达的均匀流形近似与投影图。D，检测A组小鼠支气管肺泡液中的IL6、CSF3和CCL2水平。E和F，通过流式细胞术检测A组携带肿瘤的小鼠肺部中SiglecFHi阳性中性粒细胞以及Arg1+阳性间质巨噬细胞的数量。G，携带Lkb1突变型肿瘤的小鼠分别接受了抗LIF抗体、抗CD4抗体和抗CD8抗体治疗，或同时接受这三种抗体治疗，或是接受同种型对照抗体治疗。治疗3周后，通过MRI检测了肿瘤负荷情况。H，展示LIF如何在Lkb1突变型肿瘤中诱导Sox17+细胞状态，进而招募免疫抑制性髓系细胞并削弱抗肿瘤T细胞反应的示意图。对于柱状图，每个点代表一只小鼠。显示了平均值和标准误。统计分析采用Mann–Whitney U检验法或单因素方差分析结合Tukey多重比较检验。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。[A，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/wn7dqit；H，由BioRender制作。Pillai, R. (2026) https://BioRender.com/bxa4svd.] 关闭模态框

鉴于LIF中和会减少炎症性的Sox17+肿瘤细胞状态，我们预计靶向LIF也会降低炎症细胞因子的水平以及免疫抑制性髓系细胞的浸润程度。对支气管肺泡液中的细胞因子进行分析后发现，IL6、CSF3和CCL2的水平显著下降（图6D），这一结果与Sox17基因被敲除的Lkb1突变型肿瘤的情况相似（图5B）。此外，经抗LIF抗体处理后，SiglecFHi中性粒细胞（图6E）和Arg1+间质巨噬细胞（图6F）的数量均显著减少，这表明抑制LIF信号传导能够消除已形成肿瘤中的这些免疫抑制性髓系细胞群。有趣的是，虽然总体上的中性粒细胞数量有所减少（补充图S13F），但LIF中和并未影响间质巨噬细胞的总体浸润情况（补充图S13G）。这些发现表明，肿瘤自身的LIF信号传导会影响间质巨噬细胞的转录程序，而另有某种受LKB1调控的因素则负责实际招募间质巨噬细胞。随着免疫抑制性肿瘤微环境的逆转，我们推测LIF中和有望恢复抗肿瘤T细胞反应。为验证这一假设，在肿瘤形成8周后，我们给予抗LIF抗体、抗CD4抗体和抗CD8抗体，或三种抗体联合使用，持续3周，随后检测肿瘤负荷。与同种型对照相比，LIF中和同样能有效抑制Lkb1突变肺肿瘤的生长（图6G）。在未进行LIF中和的情况下，T细胞清除对肿瘤生长并无影响（图6G）。然而，当同时进行T细胞清除时，LIF中和的效应则完全消失（图6G），这表明LIF中和的抗肿瘤作用最终是由T细胞反应介导的。总之，我们证明了Lkb1突变肿瘤会上调细胞因子LIF，后者通过自分泌信号通路诱导肿瘤可塑性，并促使Sox17+去分化肿瘤细胞状态的出现（图6H；补充图S13H）。这类去分化的肿瘤会高表达炎症介质，从而形成由SiglecFHi中性粒细胞和Arg1+间质巨噬细胞构成的免疫抑制性髓系微环境，进而削弱抗肿瘤CD4和CD8 T细胞反应。通过抗LIF疗法消除这种Sox17+肿瘤细胞状态，可逆转免疫抑制性的肿瘤微环境，重新建立由T细胞介导的抗肿瘤免疫。

目前，关于肿瘤细胞与免疫细胞之间如何相互作用以推动肿瘤生长及实现免疫逃逸，相关机制尚未被充分理解。LKB1突变肺肿瘤对常规治疗的反应较差，整体生存率也较低，这很可能是由于抗肿瘤免疫反应受到抑制所致（22, 23）。在本研究中，我们发现LKB1突变肺肿瘤的肿瘤微环境发生了显著改变。该环境中SiglecFHi中性粒细胞和Arg1+间质巨噬细胞的比例升高，且存在一种独特的免疫抑制性转录程序，会损害T细胞功能。我们确定，这种肿瘤微环境的变化是由肿瘤自身产生的LIF驱动的，LIF是一种受LKB1/SIK/CRTC2轴调控的细胞因子（28, 29），它通过自分泌信号通路诱导出一种具有Sox17表达特征的异质性炎症肿瘤细胞状态。若去除这一转录因子，肿瘤微环境中的炎症和免疫抑制现象就会得到缓解。我们还发现，通过LIF中和可以特异性地靶向并消除Sox17+肿瘤细胞状态，同时还能减少免疫抑制性髓系细胞的浸润，进而增强抗原驱动的T细胞反应。此外，我们证明，无论Trp53突变状态如何，LIF信号通路在Lkb1突变肿瘤中的作用都是不可或缺的。肿瘤是由具有不同转录程序的恶性细胞组成的异质性群体。在本研究中，我们利用肺癌基因编辑模型证明，突变状态在促进肿瘤可塑性以及LIF依赖性肿瘤细胞状态的出现过程中起着关键作用。使用基因编辑模型对于识别这类肿瘤细胞状态至关重要，它体现了让肿瘤在自然状态下多样化发展的优势，更贴近人类疾病的情况。我们的研究显示，Lkb1突变肿瘤会利用细胞因子LIF的干细胞样作用（98, 99）来诱导肿瘤细胞去分化。我们发现，这种LIF依赖性的肿瘤细胞状态的特征是SOX17的高表达，而SOX17是一种已知与组织分化相关的转录因子（91, 100）。具体而言，SOX17是内胚层发育所必需的，而内胚层随后会分化出多种细胞类型，包括肺上皮细胞（101–103）。在癌症背景下，已有研究表明SOX17对于Lkb1突变肺癌在移植模型中的转移发展起着关键作用（65），这与我们发现的Sox17+细胞状态与去分化和上皮间质转化相关一致。同样，SOX17的表达也与人类肺腺癌去分化后的内胚层状态有关（104）。与我们的研究同步，也有研究指出SOX17在结肠癌的发展中具有重要作用（86）。在原发性肺肿瘤中，我们是首次发现Sox17会形成一种促炎性的肿瘤细胞状态，该状态会干扰抗肿瘤T细胞反应。我们进一步阐明，Lkb1突变肺肿瘤会利用LIF促使癌细胞从高度分化的AT2样状态向表达Sox17的内胚层样状态转变。髓系细胞能够调节T细胞功能，因此可通过多种机制影响实体瘤中的免疫监视功能（42, 43, 49, 53）。例如，与SiglecFLo中性粒细胞相比，SiglecFHi中性粒细胞会上调多种促进肿瘤生长的转录程序，包括促进血管生成、重塑细胞外基质以及发挥免疫抑制作用（42）。此外，巨噬细胞也可能被极化，从而表现出促肿瘤或抗肿瘤效应。ARG1被认为是一种免疫抑制酶，它能限制精氨酸的供应，进而削弱效应T细胞的功能（50）。目前，尚无任何临床获批的疗法能够针对实体瘤微环境中的免疫抑制性髓系细胞（7）。我们的研究结果表明，在Lkb1突变肿瘤中抑制LIF信号传导可显著减少特定的免疫抑制性中性粒细胞和巨噬细胞亚群。有趣的是，在Lkb1突变肿瘤中删除Lifr并不会改变间质巨噬细胞的浸润情况。实际上，肿瘤内的自分泌LIF信号传导会改变这些巨噬细胞亚群的转录程序。未来还需要进一步研究以阐明LIF如何调控间质巨噬细胞中的Arg1表达。目前，针对LKB1突变肺腺癌，尚无临床获批的靶向疗法，尤其是那些能够调节免疫反应的疗法。尽管有研究显示双抗CTLA-4/抗PD-1疗法对LKB1突变肺癌有效（105），但这种基因亚型肺癌的免疫逃逸机制仍不明确。我们的研究提示，LIF阻断是一种具有潜在价值的新型治疗策略，有望提高LKB1突变肺癌患者的生存率。抗LIF抗体AZD0171目前正处于临床试验阶段，在针对晚期实体瘤患者的I期试验中表现良好且耐受性良好（NCT03490669）（36）。现在，AZD0171正在作为新辅助和辅助疗法，用于可切除的非小细胞肺癌的II期临床试验中（NCT05061550）。未来还需要进一步的亚组分析，以确定反应率是否与基因型相关。在那些局部微环境中LIF水平较高的其他实体瘤中，靶向LIF也可能取得疗效。例如，通过临床前模型研究发现，LIF在胶质母细胞瘤（37）、乳腺癌（106）、卵巢癌（107）和胰腺癌（38）中具有促肿瘤作用，因此这些实体瘤类型也可能对AZD0171产生反应。目前有一项II期临床试验正在评估AZD0171与durvalumab及化疗联合使用在晚期胰腺腺癌治疗中的效果（NCT04999969）。在本研究中，我们还发现，LIF依赖性的Sox17+细胞状态不仅具有炎症基因特征，还存在与去分化、上皮间质转化和干性相关的转录程序，而这些因素都与肿瘤对治疗的抵抗有关（95, 96, 108, 109）。我们进一步证实，通过使用抗LIF抗体可以有效消除Sox17+肿瘤细胞状态，这不仅能逆转与Lkb1突变肿瘤相关的免疫抑制性肿瘤微环境，还能降低肿瘤负荷。从临床角度来看，我们的研究代表了癌症治疗领域的范式转变，它表明通过抗LIF疗法靶向与治疗抵抗相关的肿瘤细胞状态，有望显著提升患者对常规治疗的反应率，进而提高整体生存率。细胞经洗涤后，按照上述方法进行表面标记染色。对于细胞内染色，首先将细胞在室温下用2%多聚甲醛固定10分钟，然后在室温下用0.5%皂苷处理15分钟以使细胞膜通透。随后将细胞在含Fc阻断剂的0.5%皂苷中孵育10分钟，再在室温下进行细胞内抗体染色30分钟。将细胞重新悬浮在FACS缓冲液中后，使用BD LSR Fortessa细胞分析仪对样本进行分析。所使用的抗体列表见补充表S2。

利用LIF进行体外T细胞刺激

如前文所述（112），将小鼠初始CD4和CD8 T细胞激活。72小时后，用PMA、离子霉素、Golgi Plug和Golgi Stop处理这些T细胞4小时，之后按照上述方法进行流式细胞术染色。

qPCR检测

使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从肿瘤细胞系中提取RNA。根据制造商的说明，使用SuperScript VILO（Invitrogen）从mRNA合成cDNA。qPCR检测则采用SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）进行。qPCR引物列表见补充表S1。

通过Western Blot验证Lifr基因敲除

为验证Lifr基因是否被敲除，将1234 KP LUAD细胞接种到六孔培养皿中。次日，吸出培养基并替换为无血清DMEM培养基。经过6小时的血清饥饿处理后，用重组小鼠LIF（5 ng/mL，Peprotech）刺激细胞。在冰上使用Pierce RIPA缓冲液（Thermo Scientific）裂解细胞，将细胞刮取并收集到微量离心管中。在4°C下以10,000 rpm的速度离心15分钟，收集上清液，然后使用DC Rad蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量。将蛋白质用水和4× NuPage LDS样品缓冲液稀释至2 μg/μL浓度，将样品在95°C下煮沸10分钟。随后将蛋白质加载到Invitrogen 4%至12%的Bis-Tris凝胶上，在140 V电压下电泳90分钟。接着在100 V电压下将凝胶转印到硝化纤维膜上120分钟。在室温下用5% BSA（溶于TBST中）封闭膜60分钟，然后在4°C下用一抗pSTAT3（CST 9145，稀释比例为1:1,000）和GAPDH（Santa Cruz 25778，稀释比例为1:4,000）与膜共同孵育过夜。之后用TBST清洗膜，再加入二抗。为检测信号，向膜中加入增强的化学发光辣根过氧化物酶（HRP）底物（Thermo Scientific Super Signal West PICO Plus）处理5分钟。最后使用General Electric Amersham Imager 680仪器观察凝胶图像。

批量RNA-seq分析

将肿瘤细胞分选为单细胞，且为活细胞+/死细胞?、CD45?GFP+类型。根据制造商的说明，使用Purelink RNA Mini Kit（Invitrogen）提取RNA。再按照制造商的指导，使用SMARTer PCR cDNA合成试剂盒（Clontech）从RNA合成cDNA。随后根据Illumina的说明，使用Nextera XT DNA文库构建试剂盒制备测序文库。将各样本等摩尔混合，加载到SP11循环流式细胞仪中，然后在Illumina NovaSeq 6000上进行测序。使用FASTQC（Babraham Institute）评估读取质量，再使用STAR程序（114）及默认参数将读取数据映射到GRCm38（GENCODE M25）参考基因组上。使用RSEM程序（115）计算读取数量、每百万转录本数（TPM）以及每百万千碱基对片段数（FPKM）。在R/Bioconductor环境中使用DESeq2分析不同KP肿瘤基因型间的差异表达基因（DEG）。所有图表均通过定制的R脚本生成。标志性通路数据从MSigDB（116）下载，基于所有基因的log2倍变值（FC），使用GSEA preranked程序（117）进行通路富集分析。

scRNA-seq/ExCITE-seq分析

从每种实验条件下获取约12,000个肺免疫细胞（每种遗传条件下的两只小鼠的细胞合并处理），将这些细胞分选为活细胞+/死细胞?、CD45-循环型?、CD45+类型。将肿瘤细胞分选为活细胞+/死细胞?、CD45?GFP+类型，然后在混合前与免疫细胞混合。之后使用细胞哈希抗体对样本进行多重检测。将每个样本中的细胞混合后加载到10X Chromium试剂中。使用Cell Ranger（v5.0.0）以多模式处理基因表达数据及Hashtag寡核苷酸（HTO）文库。通过Cell Ranger的“filtered_feature_bc_matrix”计数结果中的默认筛选条件，选出含有细胞的液滴。将每种检测模式得到的唯一分子标识符（UMI）计数矩阵作为独立检测项导入同一个Seurat（118, 119）对象中。根据检测到超过200个基因，且来自线粒体转录本的UMI占比低于15%的标准，筛选出存活细胞。在对哈希后的样本进行解复用之前，先使用中心对数比值转换法对HTO计数值进行归一化处理，再使用Seurat::HTODemux函数完成解复用。RNA计数值则通过Seurat::SCTransform函数进行归一化，同时结合细胞周期评分以及核糖体和线粒体比例数据进行校正。将不同条件下的细胞使用Seurat标准的scRNA-seq整合流程进行整合，其中使用了3,000个锚定基因。随后基于前40个主成分（PC）构建共享的最近邻图，再使用Leiden算法以及Seurat::FindClusters函数在不同分辨率下识别细胞群，以此发现潜在的稀有细胞类型。根据典型的细胞类型标志物对细胞类型进行标注，同时使用Seurat::FindAllMarkers函数结合逻辑回归模型，确定每个细胞群的差异表达基因。将表达相同细胞类型标志物的细胞群合并为一个细胞群。之后使用前40个主成分将细胞投影到均匀流形上以便可视化。ExCITE-seq数据的处理方式与上述scRNA-seq类似，不同之处在于细胞筛选时使用了总线粒体转录本的10%。蛋白质计数值同样通过中心对数比值转换法进行归一化。在Seurat中采用加权最近邻（WNN）方法进行多模态整合。简言之，首先使用Seurat::FindMultiModalNeighbors函数，根据标准化后的RNA和蛋白质计数数据中排名靠前的前40个和前30个主成分，为每个细胞估算出各模态的权重，进而构建WNN网络。使用Mast程序以及Seurat::FindMarkers函数对所有基因进行差异表达分析。同样基于所有基因的log2 FC值，使用GSEA preranked程序（117）进行通路富集分析。最后使用Monocle3（94, 121）进行伪时间分析。

非小细胞肺癌患者肺肿瘤的snRNA-seq分析

按照先前发表的方案（122），准备用于10x Genomics平台snRNA-seq分析的细胞核样本。简而言之，将每个冷冻样本解冻后置于CST缓冲液中浸泡10分钟，然后通过70-微米孔径的pluriStrainer过滤，在4°C下以500 g离心5分钟，使细胞核沉淀下来。将细胞核重新悬浮在不含去污剂的相同缓冲液中，再次通过10-微米孔径的pluriStrainer过滤，然后使用Nexcelom Cellometer上的AOPI仪器进行计数。按照制造商的说明，立即将大约10,000个细胞核加载到10× Chromium芯片（10x Genomics）的每个通道中，同时使用5′ V1.1化学处理试剂。将得到的cDNA和索引文库在Agilent 4200 TapeStation仪器上检测质量，之后进行定量处理并混合，最终在Illumina NextSeq 550平台上进行测序。

IHC检测

将组织在10%锌甲醛中固定48小时，然后依次通过不同浓度的乙醇和二甲苯处理，最后在Leica Peloris自动处理系统中嵌入石蜡中。按照制造商的说明，在Leica BondRX自动染色机上制作5微米厚的组织切片并进行免疫染色。简言之，首先对组织进行脱蜡处理，然后在100°C下进行表位修复。针对不同的标志物，需通过实验确定合适的修复缓冲液及修复时间。被SOX17或LKB1标记的组织使用Leica Biosystems ER1溶液（pH6，AR9961）修复20分钟，而被CD133和TTF1标记的组织分别使用ER2溶液（pH9，AR9640）修复20分钟和60分钟。修复完成后，用3% H2O2（来自Bond Polymer Refine Detection系统，产品编号DS9800）抑制细胞内的内源性过氧化酶活性。随后将切片与相应的一抗在室温下孵育：针对SOX17的一抗（Abcam，ab224637）稀释比例为1:1,000，孵育时间为30分钟；针对LKB1的一抗（CST，13031）稀释比例为1:5,000，孵育时间为60分钟；针对CD133的一抗（Invitrogen，14-1331-82）稀释比例为1:200，孵育时间为30分钟；针对TTF1的一抗（Abcam，ab133638）稀释比例为1:300，孵育时间为60分钟。被CD133标记的切片在孵育前需先用Rodent Block M（BioCare，RBM961L）封闭10分钟。SOX17、LKB1和TTF1的一抗可通过Leica BOND Polymer Refine Detection系统中所提供的抗兔HRP偶联聚合物及3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物进行检测；而CD133的一抗则通过该系统中的抗鼠HRP偶联聚合物（BioCare，BRR4016H）进行检测。最后，用苏木精对切片进行复染，再进行脱水、封片处理，最后使用Hamamatsu Nanozoomer（2.0HT）全切片扫描仪以40倍放大率对切片进行扫描。图像文件会被上传到纽约大学格罗斯曼医学院的OMERO Plus图像数据管理系统（Glencoe Software）中。切片分析则使用QuPath 0.2.3软件进行。

免疫荧光检测

组织切片的处理步骤与前述相同。在Leica BondRX自动染色机上，按照制造商的说明，采用迭代式多重免疫染色方案进行染色，所用抗体详见补充表S2。简而言之，所有切片都需依次经过Leica Biosystems的表位修复1溶液（ER1，pH 6.0，AR9961）或修复2溶液（ER2，pH 9.0，AR9640）的热修复处理，之后再进行一抗和二抗的孵育处理，最后使用Opal荧光素进行酪氨酸信号放大（相关抗体列表见补充表S1）。在一抗和二抗的去除过程中，荧光素会共价结合在表位上。使用Vectra Polaris（Akoya PhenoImagerHT）多光谱成像系统在20倍放大率下进行半自动图像采集。全切片未经混合的图像则可使用Akoya Phenochart软件查看。

人类IHC检测

在人类肿瘤微阵列上进行的显色IHC检测使用了以下抗体：未结合的多克隆兔抗人髓过氧化物酶抗体（IVD，Cell Marque，产品编号289A-78，批次号10，RRID：AB_2335990），以及抗人pSTAT3的D3A7克隆抗体（Cell Signaling Technologies，产品编号9145，批次号43，RRID：AB_2491009），后者是针对小鼠STAT3第705位酪氨酸周围序列的合成磷肽制备的。除非另有说明，否则所有IHC检测均在Ventana Medical Systems Discovery Ultra平台上，使用该公司的试剂和检测试剂盒进行。简而言之，首先将5微米厚的组织切片放置到Plus载玻片（Fisher Scientific，产品编号22-042-924）上，自然风干，随后在室温下保存待用。髓过氧化物酶的检测则是依据制造商的说明，使用经过验证的体外诊断方法进行。对于pSTAT3的检测，首先对组织切片进行脱蜡处理，然后在CC1缓冲液（TRIS-硼酸-EDTA，pH 8.5，产品编号950-500）中于99°C下进行20分钟的抗原修复处理。将抗体稀释1:100后孵育12小时，之后使用山羊抗兔HRP偶联的多聚体抗体（Ventana Medical Systems，产品编号760-4311）孵育8分钟，最后用ChromoMap RUO（产品编号760-159）DAB底物进行检测。检测完成后，用蒸馏水清洗切片，再用苏木精进行复染，通过逐步升高的酒精浓度进行脱水处理，再用二甲苯进行透明处理，最后用合成永久封片剂封片。在研究样本中还设置了适当的阳性对照和阴性对照。切片分析同样使用QuPath 0.2.3软件进行。

RNA Scope检测

组织的处理步骤与前文相同，且在实验完成后2天内切割出5微米厚的组织切片。随后按照ACDBio的方案（文档编号UM322700），使用RNAscope 2.5 LSx Reagent Kit – BROWN（ACDBio，产品编号322700）进行LIF探针的原位杂交染色。染色完成后，用苏木精对切片进行复染，封片，最后在Leica AT2全切片扫描仪上以40倍放大率进行扫描。

ELISA检测

Eve Technologies公司使用其Mouse Cytokine/Chemokine 31-plex Discovery Assay Array（MD31）对BAL液中的细胞因子/趋化因子进行多重检测。

利用TCGA数据分析人类基因表达与生存情况

从TCGA数据库（gdac.broadinstitute.org；参考文献20）中获得了515例LUAD患者的原始肿瘤RNA-seq基因表达谱及相关临床数据。从cBioPortal（123）的TCGA PanCancer Atlas数据库（gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancanatlas）中获取了这些TCGA肿瘤样本的STK11（LKB1）突变状态信息。在这515个样本中，有510个样本的突变状态如下：437个样本的STK11为野生型；73个样本存在STK11突变（包括错义突变、剪接突变或截短突变）。根据图例中的说明，将这些患者按突变状态分组，通过经验累积分布函数图展示各组标准化LIF表达水平的分布情况，同时使用Kolmogorov–Smirnov检验判断统计显著性。在生存分析中，根据LIF等基因的表达水平将患者分为高表达组和低表达组，进而进行Kaplan–Meier 5年生存分析，使用log-rank检验判断统计显著性。所有的生存分析均使用R语言中的survival包进行。所有的统计分析也都是在R统计编程语言（R-project.org）环境下完成的。

统计分析与软件

流式细胞术的数据分析使用FlowJo 10.9.0软件进行。MRI图像的分析则使用Slicer 5.3.0软件。统计分析则采用GraphPad Prism 10软件完成。数据以均值±标准误的形式呈现，P值小于0.05被视为具有显著性。包含两个以上实验组的实验采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验进行统计分析；仅有两个实验组的实验则采用双尾Mann–Whitney U检验进行分析。生存分析则采用对数秩检验。图表是使用BioRender软件生成的。数据可获取性

本文所使用的数据可在Gene Expression Omnibus数据库中找到（编号为GSE322632、GSE322570、GSE322633和GSE322634）。作者利益冲突声明

R. Pillai在研究过程中获得了NIH和Stony Wold-Herbert基金的资助；此外，他还有一项名为“针对LKB1通路异常肿瘤的治疗策略”的专利正在申请中。A. Rashidfarrokhi也有一项同类专利处于申请状态。C. Wohlhieter在研究之外还获得了Bristol Meyers Squibb的其他支持，他目前在该公司的肿瘤科工作，但在参与本研究时并未在该公司任职。F.P. Davis在研究之外还得到了Celsius Therapeutics、Caris Life Sciences和MacroGenics的支持。F.M. Simabuco在研究期间获得了圣保罗研究基金会（FAPESP）的资助。C.M. Rudin在研究之外从Amgen、AstraZeneca、Daiichi Sankyo、Genentech、Merck和Novartis获得了报酬。A.L. Moreira在研究之外得到了AbbVie和Astrazeneca的支持，以及Bristol Myers Squibb的资助。H.I. Pass在研究之外获得了Roche的支持，以及Genprex的资助，同时还从Roche获得了报酬。K.-K. Wong在研究之外获得了Janssen Pharmaceuticals、Pfizer、Bristol Myers Squibb、Zentalis Pharmaceuticals、Johnson & Johnson、Takeda、Novartis、BridgeBio Pharma、Boehringer Ingelheim、Cogent、Revolution Medicine和AstraZeneca的资助，还有来自Genentech和Allerion Therapeutics的其他支持，以及Revelio提供的非资金支持。S. Koide在研究之外获得了Aethon Therapeutics的资助、报酬及其他支持，还有来自Revalia Bio的其他支持，以及Argenx、Black Diamond Therapeutics和Puretech Health的资助，同时从Eisai获得了报酬；此外，他還有一项编号为US20240150845A1的专利正在申请中。T. Papagiannakopoulos在研究期间获得了NIH和美国癌症协会的资助，还有Kymera Therapeutics、racen Pharmaceuticals、Bristol Myers Squibb、Agios Pharmaceuticals和Pfizer Medical Education Group的资助，同时在研究之外从Faeth Therapeutics、Vividion Therapeutics、Calithera、ONCO0 Inc.和Tohoky University获得了报酬；此外，他也有一个名为“针对LKB1通路异常肿瘤的治疗策略”的专利正在申请中。其他作者则未报告任何利益冲突。作者贡献

R. Pillai：概念设计、数据整理、正式分析、监督、研究、可视化、方法设计、初稿撰写、项目管理、审稿与编辑。A. Rashidfarrokhi：概念设计、数据整理、正式分析、验证、研究、可视化、方法设计、初稿撰写、审稿与编辑。Y. Hao：正式分析、方法设计。W.L. Wu：概念设计、研究、方法设计。M.C.S. Mancini：数据整理、正式分析、研究。B. Karadal-Ferrena：数据整理、正式分析、研究。S.G. Dimitriadoy：数据整理、正式分析、研究。M. Cross：数据整理、正式分析、研究。A.H. Yeaton：数据整理、正式分析、研究。S.M. Huang：数据整理、正式分析、研究。A. Bhutkar：正式分析。A.M. Herrera：方法设计。S. Rajalingam：研究、项目管理。M. Hayashi：正式分析、研究。K.-l. Huang：正式分析。E. Bartnicki：方法设计。A.-M. Zavitsanou：方法设计。E. Ivanova：方法设计。C. Wohlhieter：资源提供。S.E. LeBoeuf：概念设计、方法设计。T. Chen：资源提供。C.A. Loomis：研究、方法设计。R. Kulicke：数据整理、研究。F.P. Davis：数据整理、研究。N. Stransky：数据整理、研究。G.A. Smolen：数据整理、研究。J.-C.J. Tsay：研究。F.M. Simabuco：方法设计。C.M. Rudin：资源提供、研究。A.L. Moreira：正式分析、研究。K.M. Khanna：方法设计。H.I. Pass：数据整理、方法设计。K.-K. Wong：数据整理、研究、方法设计。S. Koide：数据整理、验证、研究、方法设计。A. Tsirigos：数据整理、正式分析、研究。S.B. Koralov：概念设计、资源提供、数据整理、正式分析、监督、资金筹集、验证、研究、可视化、方法设计、初稿撰写、项目管理、审稿与编辑。T. Papagiannakopoulos：概念设计、资源提供、数据整理、正式分析、监督、资金筹集、验证、研究、可视化、方法设计、初稿撰写、项目管理、审稿与编辑。致谢

R. Pillai得到了William Rom奖学金、Stony Wold-Herbert基金以及NIH的T32CA009161、T32AI100853和K08CA293273号资助。M.C.S. Mancini则获得了圣保罗研究基金会FAPESP的资助（资助编号为2022/10223-6）。T.P.实验室的研究工作得到了NIH的多个资助项目（R37CA222504、R01CA227649、R01CA283049、R01CA262562和R01CA297605）以及美国癌症协会的研究学者基金（RSG-17-200-01–TBE）的支持。S.B.K.实验室的研究则得到了NIH的R01HL-125816和R01CA271245号资助，LEO基金会的LF-OC-20-000351号资助，以及纽约大学癌症中心的P30CA016087号试点项目资助。纽约大学朗格尼医学中心的人类生物样本研究与发展中心、组织学与免疫组化实验室（RRID编号为SCR_018304）的部分运营资金来自Laura和Isaac Perlmutter癌症中心支持基金、NIH/NCI的P30CA016087号资助以及NIH的S10系列资助项目，还包括NIH/ORIP的S10OD01058和S10OD018338号资助。我们还要感谢实验病理学研究实验室的成员们，该实验室的部分运营资金来自纽约大学朗格尼医学中心Laura和Isaac Perlmutter癌症中心的P30CA016087号癌症中心支持基金。Akoya Vectra Polaris多光谱扫描系统则是通过S10OD021747号共享仪器资助项目获得的。最后，我们要感谢J. Teixeira对这项工作的支持与激励。注：本文的补充数据可在《Cancer Discovery Online》网站上查看（网址：http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/）。