《Small Science》：Injectable Artificial Photoreceptors: STEM Cell Functional Integration and in vivo Electrophysiological Validation in Retinal Degeneration Models
编辑推荐：
在本研究中，研究人员工程化了一种可注射人工光感受器（APR），通过局部表面等离子体共振（LSPR）将可见光转化为细胞级电刺激，以恢复视力丧失患者的视觉。APR由金纳米颗粒（AuNPs）与聚偏氟乙烯-共-六氟丙烯（PVDF-HFP）介电涂层组成，并集成在高介电常
在本研究中，研究人员工程化了一种可注射人工光感受器（APR），通过局部表面等离子体共振（LSPR）将可见光转化为细胞级电刺激，以恢复视力丧失患者的视觉。APR由金纳米颗粒（AuNPs）与聚偏氟乙烯-共-六氟丙烯（PVDF-HFP）介电涂层组成，并集成在高介电常数钛酸钡核心上，形成一种稳定的纳米复合物，在约525 nm的绿色波段具有最大吸收。研究人员在体外使用人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞（hRGCs）评估APR，并暴露于光刺激下。在rd1小鼠模型中，通过玻璃体内注射APR后评估体内功效，并使用视觉诱发电位（VEP）和瞳孔光反射（PLR）测试评估功能结果。在体外，APR存在下对hRGCs进行光刺激增加了多电极阵列（MEA）放电。这使细胞代谢转向线粒体氧化磷酸化，且未诱导凋亡。在rd1小鼠中，玻璃体内APR递送在离体MEA中产生稳健的光诱发视网膜活动恢复，并通过增强PLR和闪光VEP上N1振幅增加，验证了体内功能读出的改善。本研究证明，一种完全可注射的纳米光子假体可以在无需植入电子设备或基因修饰的情况下，恢复视网膜变性模型中的光反应性。
**论文解读：可注射人工光感受器在视网膜变性模型中的功能整合与体内电生理验证**
**研究背景与问题**
视网膜退行性疾病，如视网膜色素变性（RP）和晚期年龄相关性黄斑变性（AMD），导致光感受器（视杆细胞和视锥细胞）丧失，进而引发进行性失明。尽管光感受器广泛退化，但内层视网膜神经元，包括视网膜神经节细胞（RGCs），仍可存活并保持电兴奋性。这为绕过受损外视网膜的策略提供了可能。现有临床和实验方法包括：视网膜上电极阵列（如Argus II）、内层视网膜细胞的光遗传学致敏以及细胞替代疗法。然而，这些方法面临挑战：手术侵入性高、空间分辨率有限、需要病毒基因转移和高强度照明。因此，存在一种未满足的临床需求，即开发一种微创、无需植入电子设备或基因修饰的视觉恢复方法。
**研究目的与意义**
研究人员开发了一种可注射人工光感受器（APR），利用金纳米颗粒（AuNPs）的局部表面等离子体共振（LSPR）特性，将可见光转化为生物电信号，直接刺激RGCs。该研究旨在验证APR在体外和体内恢复光反应性的能力，为视网膜营养不良提供一种潜在的治疗方案。该研究发表在《Small Science》。
**主要关键技术方法**
1. **纳米颗粒合成与表征**：采用改进的Turkevich法合成金纳米颗粒（AuNPs），通过聚偏氟乙烯-共-六氟丙烯（PVDF-HFP）介电涂层包覆，并基于钛酸钡纳米颗粒（BTNPs）核心组装，形成APR纳米复合物。使用动态光散射（DLS）和扫描电子显微镜（SEM）表征形态与稳定性，紫外-可见光谱（UV-Vis）确认LSPR吸收峰（约523 nm）。
2. **细胞模型与体外实验**：从人胚胎干细胞（H7-hESCs）系分化出人视网膜神经节细胞（hRGCs），使用CRISPR工程化的BRN3B-P2A-tdTomato-P2A-Thy1.2报告基因系进行纯化。体外实验包括：多电极阵列（MEA）记录光诱发hRGCs电活动；Seahorse ATP速率测定评估代谢转向氧化磷酸化（OXPHOS）；ApoTox-Glo三重复合检测评估细胞活力和凋亡（caspase 3/7活性）。
3. **动物模型与体内实验**：使用rd1小鼠（Jackson实验室）作为视网膜变性模型。通过玻璃体内注射（IVI）递送APR（1 μL，1000 μg/mL）。体内功能评估包括：视觉诱发电位（VEP）记录视觉皮层电活动；瞳孔光反射（PLR）测量瞳孔收缩程度。光学相干断层扫描（OCT）用于观察APR在玻璃体内的分布。
4. **电生理与光转换验证**：使用电压敏感染料（Di-8-ANEPPS）和化学场效应晶体管（ChemFET）直接测量APR的光-电压转换能力。
**研究结果**
**3.1 人工光感受器表现出绿色波段局部表面等离子体共振和均匀胶体形态**：通过UV-Vis光谱确认APR在520–525 nm绿色波段具有最大吸收，SEM和DLS显示均匀尺寸和分散性。
**3.2 人工光感受器实现光-电压转换**：电压敏感染料实验显示，在525 nm光刺激下，基于AuNPs的APR诱导635 nm发射，而暗场对照无信号，表明光依赖性电荷产生。ChemFET测量显示，光照使APR产生线性响应（约9 μA/lux），证明界面光-电信号转换。
**3.3 ChemFET实验**：将APR液滴置于ChemFET栅极上，施加20 mV偏压。无光时初始电流为19.280 mA，光照后电流以约9 μA/lux的线性速率增加，证明APR将光暴露转化为离子电荷。
**3.4 人工光感受器在人类视网膜神经节细胞培养中实现光诱发动作电位**：MEA记录显示，与对照相比，APR存在下hRGCs对光刺激（绿光和蓝光，不同频率）的电活动显著增强。增加光强度提高了平均放电频率（MFR），绿光刺激下MFR增加具有统计学显著性。
**3.5 光刺激人工光感受器驱动氧化磷酸化且不引起人类视网膜神经节细胞毒性**：Seahorse ATP速率测定显示，APR联合光处理降低了质子外排率（PER）和糖酵解百分比，同时显著增加了氧化磷酸化（OXPHOS）百分比，提供直接代谢证据表明APR可刺激RGCs。细胞活力和caspase 3/7活性检测表明，APR单独或联合光处理均未降低hRGCs活力或增加凋亡，支持其安全性。
**3.6 玻璃体内人工光感受器递送恢复rd1视网膜外植体的网络反应**：在rd1小鼠视网膜外植体中，APR玻璃体内注射后1天，使用绿光（530 nm）和蓝光（475 nm）以25 Hz和40 Hz频率刺激，MEA记录显示APR处理组的总放电次数、平均放电频率、活跃电极数、爆发电极数、网络爆发数和网络爆发频率均显著高于假处理rd1组，部分指标达到或超过野生型（WT）水平。
**3.7 绿光刺激**：25 Hz绿光刺激下，APR处理组的总放电次数增加605.7%，网络爆发频率增加1434.2%。40 Hz绿光刺激下，总放电次数增加218.5%，网络爆发频率增加84.6%。
**3.8 蓝光刺激**：25 Hz蓝光刺激下，APR处理组的总放电次数增加156.7%，网络爆发频率增加265.2%。40 Hz蓝光刺激下，总放电次数增加169.1%，网络爆发频率增加272.0%。
**3.9 体内功能读出确认人工光感受器注射后短暂功能恢复——瞳孔光反射**：APR注射后1天，rd1小鼠在白色光刺激下瞳孔收缩百分比显著增加（46.64% vs. 假处理rd1的3.7%），表明内层视网膜通路功能恢复。
**3.10 视觉诱发电位**：VEP记录显示，APR注射后第1天，绿光和蓝光刺激下的N1振幅均显著高于基线，第3天仍保持显著差异，但第7天N1振幅下降至基线水平，与OCT观察到的APR在玻璃体内逐渐清除一致。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，APR作为一种可注射胶体纳米复合物，通过金属核心-介电涂层-强介电核心结构，实现了有效的可见光-电压转换，并增强极性，适用于RGC生理刺激。多尺度验证（hRGCs培养、rd1视网膜外植体、体内PLR和VEP）表明，APR能有效与神经细胞界面作用，充当光探测器，并驱动细胞级按需激活，产生功能性结果。观察到的OXPHOS转变提供了激活的代谢证据，且APR未诱导凋亡。蓝光刺激总体上诱发了更高的绝对放电和网络活动，但绿光刺激下APR处理的外植体表现出更大的相对改善，这与APR在520–525 nm的吸收峰一致。VEP和PLR结果证实了APR在体内短暂恢复光反应性，但APR在玻璃体内的半衰期短（约7天），需要频繁注射。未来方向包括使用缓释胶囊（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA）延长作用时间，或改变纳米颗粒材料、介电聚合物等以优化性能。此外，需要进一步研究长期生物分布、安全性和功能耐久性，以及更高级的视觉行为评估。
结论部分翻译：营养不良性和退行性视网膜疾病，包括AMD和RP，是全球光感受器丧失的主要原因。在许多视网膜疾病中，尽管光感受器广泛丧失，内层视网膜可能保持完整和功能。因此，治疗范式包括预防光感受器丧失、再生光感受器或将治疗靶点转向内层视网膜层，从而绕过受损的光感受器层。尽管AMD治疗（特别是渗出型）取得了进展，包括抗血管生成药物和光动力疗法，以及RP治疗的研究（基因递送、神经假体视网膜植入物、光遗传学疗法、人睫状神经营养因子CNTF注射），但光感受器丧失仍然是一个没有有效治疗的挑战性领域。电刺激或光学诱导RGCs已被用于绕过受损光感受器并恢复视觉，可通过直接电刺激、假体或基于光的激活（如光门控离子通道的氨基酸和蛋白质，或本研究的纳米颗粒）实现。FDA批准的生物电植入物因设备复杂性、低图像分辨率、手术复杂性、潜在副作用和财务问题而在临床中受欢迎程度下降。同样，通过病毒载体转染光敏视蛋白使神经节细胞成为人工光感受器的光遗传学疗法结果尚不明确，目前不适用于临床。在本研究中，研究人员利用纳米复合物提供了一种新的途径，无需复杂手术、电子设备或外部光学系统。与现有视网膜假体（如Argus II、Alpha AMS和PRIMA系统）相比，可注射APR平台提供了一种微创替代方案，可通过玻璃体内注射递送。现有视网膜植入物与手术复杂性、依赖植入电子设备以及某些系统中的外部摄像机和图像处理单元相关。此外，这些植入物的刚性结构可能无法完全贴合弯曲的视网膜表面，可能导致机械不匹配、电极-视网膜耦合不佳以及与设备相关的并发症。相比之下，APR直接将入射光转化为局部电刺激，无需植入电子设备或外部电源。由于其纳米级尺寸和可注射性，APR有潜力实现更好的视网膜组织贴合性、更广泛的视网膜覆盖和降低的手术复杂性。然而，在临床转化之前，需要进一步研究其长期生物分布、安全性、生物相容性和功能耐久性。靶向RGC激活是确保APR效率和安全性的重要步骤。研究人员开发了可注射APR，显示出对不同波长和频率光刺激产生电场的潜力。当金纳米颗粒在电磁波谱的特定波长下照射时，颗粒周围的电子开始振荡，产生称为LSPR的电场。研究人员利用这一现象产生响应光刺激的电信号。此外，利用FDA批准的生物相容性聚合物PVDF包覆AuNPs形成纳米复合物，并将纳米复合物装载在钛酸钡核心上以增强介电性能，从而改善将电流有效传递到神经节细胞的能力。该产品的其他优点包括对不同刺激频率、强度和持续时间的敏感性，使其具有产生高质量自然视觉的潜力。此外，这些APR可以检测不同可见光谱，有望实现彩色视觉。本研究是临床、基础科学和工程部门之间的合作项目，涉及各领域的专家。研究人员通过各种体内和体外实验评估了APR的潜力，获得了稳健的结果。然而，未来需要解决一些局限性，为APR在临床环境中的应用铺平道路。基于OCT成像，APR在第七天后显著消失，表明半衰期短，VEP电生理研究通过显示N1振幅随时间下降证实了这一点。这是一个主要缺点，需要频繁注射以维持有效的电活动。研究人员未研究APR在眼内的分布、视网膜定位或清除途径；因此，纳米颗粒在眼内的最终命运和生物分布仍有待确定。其次，由于APR在玻璃体内的停留时间有限，本研究未设计评估其长期疗效或安全性，也未评估潜在的长期并发症，如慢性炎症、视网膜前膜形成、视网膜血管改变、眼压变化和玻璃体混浊。未来的研究需要包括长期随访、生物分布分析和组织学评估，以确定该平台的长期生物相容性和转化潜力。此外，功能疗效通过电生理（VEP）和反射性（PLR）评估进行了评估，这些评估证明了光诱发视网膜和视觉通路活动的恢复，但并未直接确定高级视觉功能的恢复。尽管这些发现为APR恢复光反应性的能力提供了重要的概念验证证据，但还需要额外的行为评估，包括视动反应、视觉悬崖和模式辨别测试，以确定功能性视觉恢复的程度，最好在更大的动物模型中进行。所有通过直接激活RGCs绕过光感受器的干预措施（如本例）的另一个局限性是，RGCs的激活不是选择性和特异性的，这意味着所有RGC类型可能同时被同一刺激激活。不出所料，rd1+APR的平均VEP曲线形状与平均WT-VEP曲线不完全相似，VEP参数的振幅和潜伏期可能进一步受到rd1小鼠视觉皮层可塑性的影响，这些小鼠从生命早期就已存在光感受器退化。此外，光强度、频率和受试者对刺激的熟悉程度等刺激参数可能影响VEP形状。纳米颗粒的稳定性及其与靶标（本例中为RGCs）的附着是开发APR的另一个关键因素。因此，未来的应用可能包括缓释胶囊，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），以将APR纳米复合物递送到目标区域，从而延长治疗时间，避免频繁注射。其他可能性包括改变纳米颗粒金属、稳定剂、介电聚合物或介电核心，以更好地将LSPR波长电子振荡电流传递到细胞，使其更稳定、更适合患者，并改善视觉恢复。有可能恢复不同颜色、频率和强度的光视觉，以及更高水平的恢复。包括连接分子或水凝胶（如聚乙二醇PEG）、肽（如精氨酰甘氨酰天冬氨酸RGD）、相变聚合物（如聚N-异丙基丙烯酰胺pNIPAM）以及前述的缓释（如PLGA）等方法，都是改善该治疗半衰期和附着性的潜在途径。此外，未来使用精确方法（如双光子光刻）在APR表面制造视网膜植入物，将是APR玻璃体内注射的替代方案。需要更多实验来进一步证明纳米复合物在替代受损或缺失光感受器中光学诱发电位RGCs的潜力。尽管如此，这是一项有前景的方法，与现有和正在开发的其他方法并列。
