一株新分离的C. perfringens噬菌体的分离、鉴定及其预防性评估

《Microorganisms》：Isolation, Identification, and Prophylactic Evaluation of a Newly Isolated C. perfringens Phage

　　

C. perfringens是引起组织毒性疾病和肠道感染的主要家畜病原体，对公共卫生以及家禽和养殖业构成严重威胁。过度依赖抗生素导致了耐药菌株的出现和肠道微生物群稳态的破坏，凸显了替代性控制策略的迫切需求。在本研究中，从内蒙古大型奶牛场的污水样本中分离出一株烈性噬菌体，命名为vB_CppII_Hohhot。最佳感染复数(MOI)被确定为0.1。评估了其pH稳定性。发现该噬菌体在pH 3至11范围内保持稳定，但在pH 12时未检测到 viable phage（检测限：<1 pfu>C. perfringens相关感染的潜力。

**研究背景与意义**
C. perfringens是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阳性、厌氧、产芽孢细菌，通过污染的饲料或土壤传播，也能由肠道微生物群失衡诱发感染，引起坏死性肠炎和肠毒血症等严重肠道疾病，对犊牛等家畜构成特别威胁。该细菌通过分泌包括α和β毒素在内的多种毒素损害肠道黏膜屏障，导致腹泻、出血甚至死亡，给全球畜牧业造成重大经济损失。传统控制策略主要依赖抗生素，但长期使用促进了耐药菌株的出现并破坏了肠道微生物群的平衡，增加了继发感染的风险。此外，其产芽孢能力使其对高温和化学消毒剂具有强大抵抗力，常规卫生管理难以彻底消除。因此，亟需开发新型、更具靶向性和生态友好的控制方法。噬菌体作为特异性靶向细菌的病毒，代表了控制C. perfringens的有前景的新型策略。噬菌体通过识别表面受体入侵宿主细菌细胞，在细胞内复制并释放子代噬菌体，最终导致细菌裂解，且极不易驱动细菌产生耐药性。本研究旨在分离鉴定新型C. perfringens噬菌体并评估其预防效用，研究人员得出结论，新分离的噬菌体具有作为抗C. perfringens感染生物控制剂的潜力。该论文发表在《Microorganisms》上，为畜牧业和人类食源性疾病中控制C. perfringens感染的创新策略提供了实验证据。

**主要关键技术方法**
样本队列来源为内蒙古呼和浩特某大型奶牛场收集的15份污水样本，以及15只健康的SPF级昆明小鼠。研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用双层琼脂平板法从污水样本中分离纯化噬菌体；通过透射电子显微镜(TEM)观察噬菌体形态；采用斑块形成试验测定噬菌体滴度、裂解谱、最佳感染复数(MOI)、热稳定性和pH耐受性；通过一步生长曲线和裂解曲线评估噬菌体的生长动力学和宿主裂解能力；利用全基因组测序分析结合MAGE-X和FastANI等软件构建系统发育树并进行功能注释；最后建立小鼠腹腔注射模型，结合组织病理学切片(H&E染色)和SYBR Green qPCR分析技术，评估噬菌体对C. perfringens感染的预防保护效果及组织内α毒素的相对表达水平。

**研究结果**

*噬菌体的分离与滴度测定*
通过点滴接种法从污水样本中分离出一株疑似C. perfringens噬菌体。在BHI液体培养基中与宿主厌氧共培养后，成功实现了对宿主菌株的完全裂解，形成清晰透明的噬菌斑。利用双层琼脂平板法测定其滴度达到1.96 × 10¹⁴ PFU/mL。根据国际病毒分类委员会(ICTV)的命名指南，该新分离的烈性噬菌体被命名为vB_CppII_Hohhot。

*形态学特征*
透射电子显微镜(TEM)观察结果显示，噬菌体vB_CppII_Hohhot具有二十面体头部和螺旋状尾部，总长度约为201.94 nm。其特征符合尾病毒纲的典型形态分类。

*噬菌体裂解谱测定*
斑块形成试验结果表明，噬菌体vB_CppII_Hohhot对C. perfringens A型具有明显的裂解活性。在针对肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和双歧杆菌等其他非目标菌株的测试中，均未检测到裂解活性，表明其裂解作用具有高度特异性。

*生物学特性*
系统测定表明，该噬菌体的最佳感染复数(MOI)为0.1。在热稳定性方面，37°C培养时滴度最高，而在温度高于45°C时滴度降至检测限以下。在pH耐受性方面，该噬菌体在pH 3至11范围内能检测到稳定滴度，但在pH 12时未检测到活性噬菌体。

*生长动力学与宿主裂解能力*
一步生长曲线显示，噬菌体在10至40分钟内快速增殖，潜伏期约为40分钟，裂解量约为14.3 PFU/cell。裂解曲线表明，在孵育14小时后，宿主C. perfringens的细菌密度显著降低（OD_600nm从0.8降至0.2-0.3，减少了60-75%），但24小时后细菌密度仍维持在零以上。

*全基因组测序与注释*
全基因组测序发现，vB_CppII_Hohhot全长基因为53,225 bp，G + C含量为34.14%，预测包含76个开放阅读框。经CARD和VFDB分析，未发现已知的抗生素耐药基因或毒力基因。将其中的gene 72重新注释为编码N-乙酰-胞苷酰-L-丙氨酸氨肽酶（一种介导宿主细菌裂解的关键内溶素）。且基因组中不存在整合酶、重组酶或抑制蛋白等溶源相关基因，确认为典型的烈性噬菌体。

*系统发育树的构建*
通过MEGA-X构建的最大似然法系统发育树显示，该分离株与Clostridium phage CPD4的全基因组相似性达97%。FastANI分析显示其与11株已知梭菌噬菌体的平均核苷酸一致性(ANI)值为97.2%至98.2%，被鉴定为现有物种内新分离的烈性噬菌体。

*C. perfringens攻毒与预防模型*
在小鼠模型实验中，C. perfringens + PBS攻毒组小鼠全部死亡，死后解剖观察到心、肝、脾、肾出血性病变，肠道气性坏疽及肺部散在出血灶；而C. perfringens + CPP裂解物组和空白对照组小鼠全部存活且器官无显著病理异常。qPCR检测显示，裂解物组各器官的α毒素相对水平与空白对照组无显著差异，但显著低于攻毒组。H&E染色结果显示，攻毒组小鼠心、肝、肺、脾、肾及十二指肠、空肠、回肠均出现严重坏死性肠炎及变性等病理损伤；而裂解物组与空白对照组组织结构一致，无明显病理损伤。

**讨论与结论**
本研究分离的噬菌体vB_CppII_Hohhot在pH 4至11及25°C至40°C下表现出较强稳定性，这符合C. perfringens的自然感染环境。尽管其在体外表现出强裂解活性，但裂解曲线测定中细菌密度在24小时后未降至零，这可能与采样时间歇性氧气暴露抑制了绝对厌氧菌有关。基因组分析未检测到已知的耐药或毒力基因，但仍存在39个未知功能基因。体内小鼠模型证实，该噬菌体能有效减轻C. perfringens引起的组织病理损伤且未见明显不良反应。然而，腹腔注射途径未能模拟肠道环境，且未对噬菌体在体内的滴度动态变化及对肠道菌群的影响进行监测。
研究结论表明，vB_CppII_Hohhot是从内蒙古奶牛场污水中分离的一株新噬菌体，属于尾病毒纲，具有二十面体头部和螺旋状尾部。该噬菌体在pH 4-11和25-40°C下稳定性强，在0.1的最佳MOI下于14小时内显著降低宿主细菌密度。基因组测序未发现已知的耐药或毒力基因。体内实验显示其能有效减轻C. perfringens引起的小鼠病理损伤。基于上述发现，vB_CppII_Hohhot被认为是基于噬菌体的 livestock 干预的有力候选者；尽管如此，其对肠道微生物群的影响和长期安全性仍需进一步研究。